ИММУНОЧИПЫ – НОВЫЙ ФОРМАТ ТЕСТ-СИСТЕМ ДЛЯ СЕРОЛОГИЧЕСКОЙ ДИАГНОСТИКИ ИНФЕКЦИОННЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ

Разработка тест-систем в формате иммуночипа для диагностики инфекционных, аллергических и аутоиммунных заболеваний
Почему формат иммуночипа?

ИФА
Иммуночип
ИФА
vs

+
Иммуноблот
+
Иммуночип
VS
Иммуноблот

Технологии не для каждой лаборатории
Evidence (RANDOX)
BioPlex (BIO-RAD)

В основу современного алгоритма серологической диагностики заложена необходимость проведения повторного тестирования для верификации результатов анализа

+
=
Иммуночип
– одноэтапный тест для выявления
большого числа значимых биологических маркеров заболеваний, высокая информативность,
возможность сочетания скрининга и подтверждения в одном формате
сопоставимый (или >)
по чувствительности с ИФА,
а по специфичности с иммуноблотом

Принципиальное отличие биочипов –
возможность выявления в одном анализе множества маркеров
15 Цитокинов

Аллергочип ImmunoCAP ISAC IgE
Общее время проведения реакции на чипе – около 5 часов
Минимальное количество образца – 20 мкл на 103 аллергена
Простота постановки

Новая технология бесконтактной микропечати с помощью современных наноплоттеров
Позволяют печатать
на слайды или дно лунок планшетов

1 чип (слайд) = 1 образец
1 слайд = 16 образцов, 16 Х 4 = 64 образца
1 планшет = 96 образцов

Эррей – лунка планшета
Флуоресцентный профиль эррея на альдегидном слайде
Иммуносорбенты для планарных чипов высокой плотности –
активированные микроскопные слайды
и полистироловые планшеты

КАНАЛ Cy5
(антитела IgG)
КАНАЛ Cy3
(антитела IgM)
Детекция антител разных классов
в одной постановке в одном эррее

Себестоимость анализа при использовании разных серологических методов
Число анализируемых инфекций
(количество маркеров на одну инфекцию = 5)

Принципы размещения антигенов
и антител на одном иммуночипе

Схема проведения анализа с помощью иммуночипа
Разведение сывороток
Инкубация с образцом, 370С
Детекция
Отмывка
Отмывка
Инкубация c коньюгатом, 370С

ТЕСТ-СИСТЕМЫ
В ФОРМАТЕ ИММУНОЧИПОВ,
РАЗРАБАТЫВАЕМЫЕ В ЦНИИЭ

+
-
Дизайн эррея иммуночипа для серодиагностики
Лайм-боррелиоза

Чувствительность и специфичность иммуночипа
для cеродиагностики ИКБ
(клинический материал предоставлен и охарактеризован клиническими базами: МОНИКИ, НИИР РАМН, Центрами санэпиднадзора - г. Ижевск, г.Киров, г.Ярославль, г. С.-Петербург)

Сравнительное изучение выявления специфических антител в сыворотках крови больных ИКБ
в различных тест-системах
(процент выявления антител,
ограниченная выборка клинического материала, n=42)
%

Изучение дискордантных образцов в иммуноблоте
на наличие антител класса М

Rickettsia
F.tularensis
Инфекции передаваемые клещами рода Ixodes

Иммуночип для выявления cпектра трепонемоспецифических и реагиновых антител
классов G и M, ассоциированных с сифилисом

Результаты изучения чувствительности и специфичности иммуночипа для диагностики сифилиса

Иммуночип для серодиагностики
TORCH-инфекций
Одновременное выявление антител разных классов при использовании смеси конъюгатов (анти-IgG, - IgM, - IgA), меченых флуорофорами, отличающимися по спектральным характеристикам)
Одновременное выявление антител к разным инфекциям на одном стекле
1 иммуночип на комплекс TORCH =
16 ИФА-тест-систем

Дизайн одного эррея для серологической диагностики
TORCH-инфекций

Флуоресцентная детекция спектра антител
разных классов: IgG и IgM
конъюгат анти-IgM человека-Сy3
конъюгат анти-IgM человека-Сy3
+
Канал Cy3
Канал Сy5
+
-
+
-

Совпадение результатов, полученных в иммуночипе,
с данными ИФА при тестировании сывороток
(всего- 700 шт)

Определение значимых маркеров к ВИЧ 1 и 2 типов, ВГС, сифилису
Канал внутреннего
контроля - FITC
Канал учета
специфической
реакции – Сy5
gp120, gp160, gp41, pol, gag, env(ВИЧ2),
AТ p24, сore, NS3, NS4, NS5, Tp47,
Tp17, Tp15, TmpA, IgG, анти-IgG, буфер

Оценка чувствительности иммуночипа «ВИЧ-ВГС-сифилис»
(n = 1290 образцов)

Оценка специфичности иммуночипа «ВИЧ-ВГС-сифилис»
(n = 678 образцов)

Иммуночип для детекции ООИ
( B.anthracis, Y.pestis)
для B.anthracis
для детекции Y.pestis
Аb
SA26
Ab
IgG F1
К -
BSA-Cy5
К -
(ФЦП «Национальная система химической и биологической безопасности РФ“)
Один эррей

Примеры флуоресцентных паттернов.
Аналитическая чувствительность
Y.pestis
B. anthracis
10 3 cells/ml
10 7 cells/ml
10 4 cells/ml
10 5 cells/ml
10 6 cells/ml
10 3 cells/ml
10 4 cells/ml
10 5 cells/ml
10 6 cells/ml
10 7 cells/ml

ДНК-чип для детекции B.anthracis, Y.pestis, F.tularensis
pagA
Bacilus anthracis
Yersinia pestis
Francisella tularensis
CapA
capB
IglBC
FopA
RD1
mVin
pla
caf1
caf1
caf2
Ypo 0394
Ypo 0397
Printing buffer

Схема анализа с помощью ДНК-чипа
Выделение ДНК из материала
ПЦР-амплификация
последовательность промотора T7-RNA полимеразы включена в структуру обратных праймеров
Транскрипция (15-30 мин)
Гибридизация на DНК-чипе (30 мин)
Детекция положительных сигналов на чипе с использованием стрепатавидин-Cy5 (15-20 мин)
Сканирование и анализ результатов
пробо-
подготовка
on-chip
анализ

Примеры флуоресцентных паттернов после гибридизации на ДНК-чипе
B.a. mix
Y.p. mix
F.t. mix
B.a.+ Y.p + F.t. mix
Штамм B. anthracis
F.tularensis штамм
Y.pestis антиген
Праймеры
Материал

Наши планы
Регистрация тест-систем для серодиагностики TORCH, cифилиса, трансфузионных инфекций, боррелиоза.
Разработка программы для обсчета результатов и формирования клинического отчета, удобного для врача-лаборанта.
Организация производства биочипов.
Взаимодействие с клиническими базами.
5 ……..