Изучение генетического контроля устойчивости зерновых культур к болезням (на примере листовой ржавчины пшеницы)

Создание устойчивых к грибным заболеваниям сортов хлебных злаков составляет одну из очередных задач современной селекции сельско-хозяйственных растений (Вавилов, 1913) .
Симптомы поражения листовой ржавчиной
А – флаг-листья; B – ювенильные растения.

Взаимодействие двух аллелей в локусе устойчивости (R r)
и двух аллелей в локусе вирулентности (V v)
Важнейшие для селекции следствия из теории Флора
Сорта, защищенные единичными генами устойчивости, должны быстро терять устойчивость, т.к. достаточно мутации одного гена патогена для его превращения из авирулентного в вирулентный
Необходим постоянный поиск новых генов устойчивости
В селекции следует использовать не просто устойчивые образцы, а носители конкретных эффективных генов устойчивости.

Индукция устойчивости к листовой ржавчине под действием
бензимидазола
Выделение источников устойчивости

Тип реакции на заражение сборной популяцией P. recondita образцов пшеницы, имеющих по литературным данным новые эффективные гены ювенильной устойчивости

Критерии сходства (r) и идентичности (I) для сборов клонов P. triticina с одного образца пшеницы

Характеристика по вирулентности субпопуляций
P. triticina, собранных с одного образца пшеницы в разные сроки

АНАЛИЗ РОДОСЛОВНЫХ
1. Аутентичность изучаемого образца.
2. Знание реакции на заражение патогеном всех генотипов,
входящих в родословную.
3. Только уже известные гены устойчивости могут
контролировать признак у изучаемых образцов.

ГИБРИДОЛОГИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ

Ожидаемые расщепления по устойчивости в F3 от скрещивания устойчивого и
восприимчивого к ржавчине родителей
.
* R – устойчивые семьи; S – восприимчивые семьи; RS – семьи, расщепляющиеся по устойчивости

Значения χ2 для гипотез генетического контроля устойчивости к ржавчине образца MN 81330 по результатам расщепления в F2 от скрещивания с Мильтурум 7526

Значения χ2 для гипотез генетического контроля устойчивости к ржавчине
по результатам расщепления в F3 от скрещивания MN 81330 × Мильтурум 7526
Идентификация гена
Скрещивание изучаемого образца с носителями конкретных генов устойчивости
F2 MN 81330 × Scua 213 R : 0 S

- - + - + -
Ген Lr13
Образцы пшеницы
1 2 3 4 5 6 ThLr13
Клон патогена
1
2
3
4
6
5
Если опытный образец устойчив ко всем независимо выделенным авирулентным к конкретному гену устойчивости изолятам, то он имеет этот ген резистентности; в случае восприимчивости хотя бы к одному из этих изолятов надежно постулируется отсутствие данного гена у образца.
Фитопатологический тест

Клон 1 Клон 2
Образец 1 + –
Образец 2 – +
Различные гены устойчивости
Разные аллели одного гена устойчивости
Один идентичный ген устойчивости + различные гены устойчивости
Тест на аллелизм
Строго доказано, что 2 образца имеют по одному гену устойчивости к конкретному инокулюму
Отсутствует расщепление в F2 от их скрещивания
Дифференциальная реакция на клоны патогена.

Рис. 2. Схема Полимеразной цепной реакции (ПЦР)

Аллель устойчивости
Продукт амплификации
Аллель восприимчивости
Продукт амплификации Нет
Рис.3 Схема идентификации гена устойчивости с использованием ПЦР ДНК маркера

Преимущества
1. срок идентификации
2. отсутствие супрессии
3. независимость от внешних условий
4. большое количество маркеров (∞).

Гены устойчивости пшеницы к листовой ржавчине,
для которых разработаны ПЦР ДНК маркеры
(по McIntosh et al, 2008)
Lr1, Lr3, Lr9, Lr10, Lr13, Lr14a, Lr16, Lr19, Lr20, Lr21, Lr22, Lr24, Lr25,
Lr26, Lr28, Lr29, Lr32, Lr34, Lr35, Lr37, Lr39, Lr46, Lr47, Lr50, Lr51, Lr52,
Lr57, Lr58.

Публикации, в которых идентификация генов устойчивости пшеницы
к листовой ржавчине осуществлена только по результатам анализа
ПЦР ДНК маркеров
Гайнуллин Н.Р., Лапочкина И.Ф., Жемчужина А.И., Киселева М.И., Коломиец Т.М., Коваленко Е.Д. Использование фитопатологического и молекулярно-генетического методов для идентификации генов устойчивости к бурой ржавчине у образцов мягкой пшеницы с чужеродным генетическим материалом // Генетика. 2007. Т. 43. С. 1058-1064.
Гультяева Е.И., Канюка И.А., Алпатьева Н.В., Баранова О.А., Дмитриев А.П., Павлюшин В.А. Молекулярные подходы в идентификации генов устойчивости к бурой ржавчине у российских сортов пшеницы // Доклады РАСХН. 2009. № 5. С. 23-26.
Дженин С.В., Лапочкина И.Ф., Жемчужина А.И., Коваленко Е.Д. Доноры устойчивости яровой мягкой пшеницы к бурой ржавчине и мучнистой росе с генетическим материалом видов Aegilops speltoides L., Aegilops triuncialis L., Triticum kiharae Dorof. et Migusсh. //ДокладыРАСХН. 2009. N 5. С. 3-7.
Урбанович О.Ю., Малышев С.В., Долматович, Картель Н.А. Определение генов устойчивости к бурой ржавчине в сортах пшеницы (Triticum aestivum L.) с использованием молекулярных маркеров // Генетика. 2006. V. 42. С. 675-683.
Stepien L., Golka L., Chelkowski J. Leaf rust resistance genes of wheat: identification in cultivars and resistance sources // J. Appl. Genet.. 2003. V. 44. P. 139-149.
Greganova Z., Kraic J., Galova Z. Diagnostic of wheat leaf rust resistance genes by DNA markers and their application in mas // Czech J. Genet. Plant Breed. – 2003. – V.39. – P.127–129.
Wioeniewska H., Stкpieс Ј., Kowalczyk K. Resistance of spring wheat cultivars and lines to leaf rust // J. Appl. Genet. 44(3), 2003, P. 361-368
Singh R., Tiwari R., Datta D. Detection of Leaf Rust Resistance Genes Lr9 and Lr10 in Wheat (Triticum aestivum) by PCR Based STS Markers //Acta Phytopath et Ent. Hungarica. 2003. V. 38. P. 245-249.
Babar M., Mashhadi A.F., Mehvish A. et al. Identification of rust resistance genes Lr10 and Sr9a in Pakistani wheat germplasm using PCR based molecular markers //African Journal of Biotechnology. 2010. Vol. 9(8), pp. 1144-1150

Аллель устойчивости
Мутации
аллель устойчивости + аллель устойчивости –
маркер – маркер +
Рекомбинация аллель устойчивости + аллель устойчивости –
маркер – маркер +
Рис.4 Возможные механизмы нарушения связи наличия аллеля устойчивости и ПЦР ДНК маркера

Аллель устойчивости
Мутации
аллель устойчивости + аллель устойчивости –
маркер – маркер +
Рекомбинация аллель устойчивости + аллель устойчивости –
маркер – маркер +
Рис.5 Возможные механизмы нарушения связи наличия аллеля устойчивости и ПЦР ДНК маркера

М 1 2 3 4 5 6 7 М
Рис. 6. Продукты амплификации с использованием праймеров J 13 к STS локусу, сцепленному с геном устойчивости Lr9.
М – маркер молекулярного веса, 1 – АНК-4, 2 – Гарасовскя 5, 3 – Зоя, 4 – Квинта, 5 – Киевская, 6 – Cep 14 –Tapes, 7– Thatcher.
1100 п.о.
Абсолютное совпадение результатов идентификации гена устойчивости мягкой пшеницы к листовой ржавчине с помощью ПЦР ДНК маркера, гибридологического анализа и фитопатологического теста

Таблица 1. Характеристика образцов, выделенных как имеющих ген Lr9, по устойчивости к листовой ржавчине и наличию амплифицированного фрагмента STS маркера J13.

Рис. 7 Продукты амплификации с использованием праймеров J09 к STS локусу, сцепленному с геном устойчивости Lr24.
М – маркер молекулярного веса, 1 – N89L, 2 – Siouxland 89, 3 – Parker 76, 4 – Arapohoe, 5 – Лавина, 6 –Stoa, 7 – STW 646252, 8 – Torres, 9 – PS 131, 10 – PS 133, 11 – Scua, 12 – BR- 34, 13 – PF 84316, 14 – Sunco, 15 – Thatcher.
М 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 М
310 п.о.
Не полное совпадение результатов идентификации гена устойчивости с помощью ДНК маркера, гибридологического анализа и фитопатологического теста

Таблица 2. Характеристика образцов, выделенных как имеющих ген Lr24, по
устойчивости к листовой ржавчине и наличию амплифицированного фрагмента
STS маркера J9.

Не совпадение результатов идентификации генов устойчивости с помощью ДНК маркеров и фитопатологического теста образцы, для которых выявлено не совпадение отмечены красным)
Таблица 3. Типы реакции сортов мягкой пшеницы на заражение клонами P. triticina,
авирулентными к гену устойчивости Lr1

Таблица 4. Типы реакции сортов мягкой пшеницы на заражение клонами P. triticina, авирулентными к гену устойчивости Lr20
Таблица 5. Типы реакции сортов мягкой пшеницы на заражение клонами P. triticina, авирулентными к гену устойчивости Lr26

Таблица 6. Типы реакции сортов мягкой пшеницы на заражение клонами P. triticina, авирулентными к гену устойчивости Lr10

Таблица 7. Типы реакции сортов мягкой пшеницы на заражение клонами
P. triticina, авирулентными к гену устойчивости Lr34

100 п.о.
М 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22
Р и с. 8 Продукты амплификации с использованием праймеров WMS130 к SSR локусу Xgwm130, сцепленному с геном устойчивости Lr34
М – маркер молекулярного веса, 1 – Thatcher Lr13, 2 – Chris, 3 – Neepawa, 4 – Thatcher Lr10, 5 – Mayo 54, 6 – Mayo 52,
7 – Эскада 70, 8 – Hope, 9 – Piko, 10 – Rendezvouz, 11 – Prospect, 12 – Прохоровка, 13 – Эстер, 14 – Родина,
15 – Thatcher Lr34, 16 –Doubleсrop, 17 – Lerma Rojo 64, 18 – Roblin, 19 – Заря, 20 – Manitou, 21 – Pasqua, 22 – Thatcher.
Т а б л и ц а 8 . Типы реакции отрезков листьев образцов пшеницы на инокуляцию
монопустульными изолятами P. recondita f.sp. tritici

300 п.о.
М 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22
Р и с. 9 Продукты амплификации с использованием праймеров к STS локусу F12245 , сцепленному с геном
устойчивости Lr10
М – маркер молекулярного веса, 1 – Thatcher Lr13, 2 – Chris, 3 – Neepawa, 4 – Thatcher Lr10, 5 – Mayo 54, 6 – Mayo 52,
7 – Эскада 70, 8 – Hope, 9 – Piko, 10 – Rendezvouz, 11 – Prospect, 12 – Прохоровка, 13 – Эстер, 14 – Родина,
15 – Thatcher Lr34, 16 –Doubleсrop, 17 – Lerma Rojo 64, 18 – Roblin, 19 – Заря, 20 – Manitou, 21 – Pasqua, 22 – Thatcher.
Т а б л и ц а 9 . Типы реакции отрезков листьев образцов пшеницы на инокуляцию
монопустульными изолятами P. recondita f.sp. tritici

НЕ СОВПАДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ИДЕНТИФИКАЦИИ ГЕНОВ УСТОЙЧИВОСТИ Lr 9 и 24 У ОБРАЗЦОВ AEGILOPS UMBELLULATA И ЛИНИЙ МЯГКОЙ ПШЕНИЦЫ С ЧУЖЕРОДНЫМИ ТРАНСЛОКАЦИЯМИ С ПОМОЩЬЮ ДНК МАРКЕРОВ, И ФИТОПАТОЛОГИЧЕСКОГО ТЕСТА

Таблица 10. Характеристика образцов Aegilops umbellulata по устойчивости
к листовой ржавчине и наличию амплифицированного фрагмента STS
маркера J 13
1500 п.о.
850 п.о.
Рис. 11 Продукты амплификации с использованием праймеров J 13 к STS локусу, сцепленному с геном устойчивости Lr9. М – маркер молекулярного веса, 1 – к-1283, 2 – Thatcher, 3 – ThLr9 , 4 – к-2029, 5 – и-570230, 6 – к-1461, 7– и-570116, 8 – и-570032, 9 - и-539427.
М 1 2 3 4 5 6 7 8 9

Гайнуллин и др. , 2007.
Дженин и др., 2009.
Таблица 11. Характеристика образцов мягкой пшеницы с чужеродным генетическим материалом по наличию ДНК маркеров и вирулентных клонов возбудителя листовой ржавчины