Лабораторна оцінка характеристик біологічно активних препаратів з протизапальними властивостями на прикладі бетаїну

Актуальність проблеми
Попередження небажаних наслідків доступної, дешевої і, як наслідок, менш якісної дієти дозволить покращити здоров’я тварин та підвищити їх продуктивність не збільшуючи вартість їх утримання, що в свою чергу позитивно вплине на рентабельність тваринництва – яка є ключовим моментом для інвесторів та фермерів.
Загострення проблем охорони здоров'я (пандемія Covid-19, і, як наслідок, погіршення матеріального достатку й психологічного здоров'я населення, що загострили питання здорового харчування та алкоголізму серед населення) збільшило кількість й масштаб досліджень у цих «проблемних» напрямках – а отримані найновіші й більш глибокі дані можуть бути застосовані у ветеринарній медицині.
Мета роботи
Дослідження впливу бетаїну на клітини, що є мішенями за розвитку АХП, НАЖХП та Covid-19, для створення у подальшому стандартного протоколу досліджень біоактивних препаратів «ОВА+» та «Біофосфомаг».
Завдання роботи
Дослідити особливості запальних процесів за АХП, НАЖХП та Covid-19. Вивчити механізм цитокін опосередкованої протизапальної дії бетаїну та проаналізувати його потенційну ефективність за даних паталогій.
Враховуючи особливості вищезазначених процесів, обрати тип клітин для подальших досліджень на клітинних моделях.
Провести першу серію експериментів на клітинній моделі для дослідження загального впливу різних концентрацій бетаїну на клітини, і проаналізувати отриманні результати.

Протизапальна дія бетаїну базується на здатності пригнічувати продукцію IL-1β за допомогою канонічних (регулює активацію TLR4…) і неканонічних механізмів.
За АХП механізм запалення зумовлений активацією метаболітами кишкової мікробіоти рецептора TLR4, що призводить до вивільнення цитокінів й алкогольного ураження печінки.
За НАЖХП відбуваються два паралельні процеси розвитку запалення. Перший – активація метаболітами кишкової мікробіоти рецептора TLR4 й подальшого синтезу цитокінів. Другий пов’язаний із жировою тканиною, що бере участь у секреції адипонектину, лептину, TNF й IL-6, а також є джерелом пальмітинової кислоти, цераміду – що порушують функції мітохондрій, викликають окисний стрес і загибель адипоцитів.
За COVID-19 процеси запалення зумовлені продукцією саме IL-1β.
Клітини-мішені – ендотеліоцити.

Матеріали та методи
Експеримент було поставлено на клітинах лінії РАЕ (ендотеліальні клітини аорти свині). Культивували клітини у середовищі DMEM (Sigma, США) з 10% сироватки зародка бика (Sigma, США) – у інкубаторі CO2 за 95% вологості, 5% вмісту CO2 та при температурі 37 ± 1 ° C.
Підрахунок клітин проводився за допомогою світлового мікроскопу у камері Горяєва.
Оцінка морфологічних даних проводилась за допомогою інвертованого мікроскопу AxioVert (Carl Zeiss) – із програмним забеспеченям AxioVision. Фотографували за допомогою Digital Still Camera із об’єктивом Carl Zeiss Vario-Sonar.
Рівень поглинання глюкози визначали методом на основі реакції із глюкозооксидазою.
Активність мітохондріальних ензимів, переважно сукцинатдегідрогенази (КФ 1.3.5.1) – за допомогою МТТ тесту.
Концентрацію ТБК-активних сполук, а саме малонового диальдегіду (МДА), рівень загальних SH-груп, та активність каталази (КФ 1.11.1.6) – згідно зазначених методів відповідно [18-20].
Статистичну обробку даних проводили за допомогою комп’ютерної програми «STATISTICA 8.0».

Таблиця 1 - Концентрація клітин та відсоток мертвих клітин за різних концентрацій бетаїну.
Прим. *- р<0,05, порівняно з контролем
Підтверджено відсутність токсичного ефекту за дії бетаїну у різних концентраціях. Фарбування трипановим синім показало збільшення концентрації ендотеліоцитів порівняно із контрольним зразком – за концентрації бетаїну 0,5 мг/мл та 1 мг/мл (табл. 1).
Зафіксовано збільшення поглинання глюкози клітинами за концентрації бетаїну 1 та 0,125 мг/мл, що свідчить про посилення активності метаболічних процесів (табл. 2). Слід зазначити, що збільшення концентрації бетаїну до 2 та 4 мг/мл майже не вплинуло на інтенсивність поглинання глюкози клітинами – що можна пояснити впливом такої концентрації препарату на осмотичні процеси і як наслідок, процес транспорту глюкози до клітини.
Прим. *- р<0,05, порівняно з контролем
Таблиця 2 - Рівень поглинутої глюкози ендотеліоцитами за дії бетаїну

Активність мітохондріальних ензимів (переважно сукцинатдегідрогенази) суттєво зросла за концентрації 2 мг/мл та 4 мг/мл – на 33% та 40% відповідно. І майже не змінилась за концентрації 1 мг/мл і менше (рис. 2). Це свідчить про збільшення інтенсивності процесів енергетичного метаболізму, зокрема підвищення активності електрон-транспортного ланцюга та процесів окиснювального фосфорилювання.
Рис. 2 - Відсоток оптичного поглинання порівняно з контролем за дії бетаїну визначені в МТТ-тесті.

Рис. 3 - Активність каталази за дії бетаїну.
Рис. 4 - Рівень загальних SH-груп та ТБК-вмісних сполук.
Зафіксовано збільшення активності каталази на 46% за концентрації бетаїну 2 мг/мл (рис. 3). Враховуючи, що рівень активності каталази напряму залежить від кількості її субстрату (перекису водню), можна казати про збільшення продукції активних форм кисню.
Також за концентрації 2 мг/мл спостерігалось значне зниження (майже на 20%) рівня загальних SH-груп (рис. 4), тобто можна казати про зниження кількості відновленого глутатіону (GSH). Існують дві імовірні причини цього. Перша пов’язана із окисненням відновленого глутатіону (GSH) до окисненої форми (G-S-S-G) – аргументом цього є збільшення активності каталази. Друга стосується впливу бетаїну на метіоніновий цикл, а саме, він зменшує продукцію попередника глутатіона у цьому циклі – гомоцистеїну.
Відсутність збільшення кількості МДА (рис. 4) свідчить про відсутність наслідків окисного стресу, не зважаючи на підвищення інтенсивності окисно-відновних процесів у клітинах.

Висновки
Бетаїн може бути ефективним протизапальним засобом за АХП та Covid-19 через його здатність інгібувати секрецію IL-1β, а його здатність стимулювати метаболічні й проліферативні процеси ендотеліальних клітин, дисфункція яких є складовою патогенезу АХП, НАЖХП та Covid-19, є аргументом щодо його потенційної терапевтичної ефективності за даних патологій.
Найбільш перспективною для подальших досліджень є концентрація бетаїну 1 мг/мл – за такої концентрації фіксувалось збільшення поглинання глюкози клітинами, та відмічався розвиток як морфології окремих клітин, так і ускладнення їх структури у просторі. Менші концентрації – 0,5 та 0,125 мг/мл – не продемонстрували достовірних змін порівняно із контролем. Збільшення концентрації до 2 мг/мл і вище сприяло підвищенню продукції активних форм кисню, що відповідним чином навантажило антиоксидантні механізми клітин (каталаза, глутатіон).
Отримано експериментальні дані оцінки біоактивного препарату (бетаїну), які в майбутньому ляжуть в основу проєкту протоколу лабораторних досліджень біопрепаратів – «ОВА+», «Біофосфомаг» та інших.