МАСС-СПЕКТРОМЕТРИЯ В ПРОТЕОМНЫХ ИССЛЕДОВАНИЯХ

Белки и пептиды
Моноизотопные массы
аминокислотных остатков
ADLKQLMDNEVLMAFTSYATIILAKMMFLSSATAFQRLTNKVFANPEDCAGFGKGENAKKFLRTDEKVERVRRAHLNDLENIVPFLGIGLLYSLSGPDLSTALIHFRIFVGARIYHTIAYLTPLPQPNRGLAFFVGYGVTLSMAYRLLRSRLYL
(Глутатион-трансфераза человека)
пептидная
связь
аминокислотный
остаток

SAPASTTQPIGSTTSTTTKTAGATPATASGLFTIPDGDFFSTARAIVASNAVATNEDLSKIEAIWKDMKVPTDTMAQAAWDLVRHCADVGSSAQTEMIDTGPYSNGISRARLAAAIKEVCTLRQFCMKYAPVVWNWMLTNNSPPANWQAQGFKPEHKFAAFDFFNGVTNPAAIMPKEGLIRPPSEAEMNAAQTAAFVKITKARAQSNDFASLDAAVTRGRITGTTTAEAVVTLPPP
(Белок оболочки Х-вируса картофеля)
Пептидный фингерпринт
Num From-To MH+ HPLC pI Sequence
1 1- 19 1836.92 14,27 9,85 SAPASTTQPIGSTTSTTTK
1 1- 19 1878.93 14,27 9,85 SAPASTTQPIGSTTSTTTK
2 20- 44 2472.20 24,79 3,92 TAGATPA..PDGDFFSTAR
3 45- 60 1602.83 12,87 4,11 AIVASNAVATNEDLSK
4 61- 66 759.44 19,33 6,99 IEAIWK
5 67- 69 393.18 4,27 6,99 DMK
6 70- 84 1673.83 19,51 3,92 VPTDTMAQAAWDLVR
7 85-109 2595.13 22,48 4,34 HCADVGSS..GPYSNGISR
8 110-111 246.16 1,78 11,20 AR
9 112-117 586.39 12,82 10,10 LAAAIK
10 118-123 719.36 14,84 6,29 EVCTLR
11 124-128 655.28 17,08 8,68 QFCMK
12 129-157 3410.65 28,07 9,42 YAPVVWNWM..QGFKPEHK
13 158-176 2058.02 24,21 6,97 FAAFDFFNGVTNPAAIMPK
14 177-198 2330.18 20,92 4,60 EGLIRPPS..AAQTAAFVK
15 199-201 361.25 6,80 10,15 ITK
16 202-203 246.16 1,78 11,20 AR
17 204-218 1565.76 14,77 3,92 AQSNDFASLDAAVTR
18 219-220 232.14 2,11 11,15 GR
19 221-236 1567.86 17,90 3,15 ITGTTTAEAVVTLPPP
Num From-To MH+ HPLC pI Sequence
1 1- 56 5430.68 29,08 4,35 SAPASTTQPI…IVASNAVATNE
1 1- 56 5472.69 29,08 4,35 SAPASTTQPI…IVASNAVATNE
2 57- 62 704.38 12,90 4,11 DLSKIE
3 63- 96 3730.75 28,42 4,58 AIWKDMKVPT..ADVGSSAQTE
4 97-118 2334.22 22,73 9,58 MIDTGPYSNGISRARLAAAIKE
5 119-155 4353.07 35,01 9,02 VCTLRQFCMKY…NWQAQGFKPE
6 156-177 2452.21 24,30 7,58 HKFAAFDFFNGVTNPAAIMPKE
7 178-185 868.49 16,16 7,04 GLIRPPSE
8 186-187 219.10 1,83 3,25 AE
9 188-228 4255.19 24,38 10,52 MNAAQTAAFV…RGRITGTTTAE
10 229-236 793.48 14,07 6,96 AVVTLPPP
Трипсин ( /R,K)
Стафилококковая протеаза V8 ( /E)
Пептидный калькулятор GPMAW 4.04

1 определение количества того или иного белка в образце
2 идентификация белка
3 уточнение первичной структуры
4 определение пост-трансляционных модификаций
ПРЕДПОСЫЛКИ:
Реализация программы Геномика –
быстрое секвенирование ДНК,
создание баз данных нуклеотидных последовательностей
Развитие инструментальных методов –
масс-спектрометрия белков и пептидов,
сопряжение с методами разделения
ПРОТЕОМИКА – совокупность высокотехнологичных методов изучения белков:

Общий вопрос - что измеряется?
Масс- спектрометрия –
расчет молекулярной массы ионов
по их поведению в электрических и/или магнитных полях
Сила, действующая на ион массы m и заряда z
в однородном электрическом поле:
Сила, действующая на ион массы m, заряда z, скорости v
в однородном магнитном поле:
Примеры:
Fq = zeE
FL = ze[vxB]
a = (z/m)eE
a = (z/m)e[vxB]
m/z
МАСС-СПЕКТРОМЕТРИЯ БЕЛКОВ И ПЕПТИДОВ

Источник
ионов
Система разделения
ионов
Детектор
Общая схема масс-спектрометра
MALDI
ESI
Времяпролетные (TOF)
Квадрупольные (Q)
Ионные ловушки (IT)
Ионно-циклотронного резонанса (ICR-FT)
Микроканальные
пластины (MCP)
Диноды
Магнит (ICR-FT)
Положительные: - захват протона либо другого катиона (Na, K);
- потеря электрона (катион-радикал).
Отрицательные: - утрата протона;
- захват электрона.
Типы ионов

ESI – электрораспыление и ионизация
Растворители:
вода, ацетонитрил, метанол
Анализируемое вещество
подается в растворе через капилляр с поданым на него напряжением.
несколько последовательных
«упариваний-взрывов» микрокапель
В результате получаются
многозарядные газофазные ионы, захватившие на себя разное
количество протонов,
вплоть до максимально возможного.
ИСТОЧНИКИ ИОНОВ

МАТРИЦА:
* Поглощает энегрию лазерного излучения,
“вскипая”, увлекает в газовую фазу
молекулы анализируемого вещества
* Способствует ионизации
Матрицы для УФ лазера (336нм)
Лазер: 2нс, 50-300 мкДж/имп , 50мкм
Анализируемое вещество
(раствор 10-4 -10-8 М, <1 мкл)
смешивается с матрицей
(раствор 10-1 -10-2 М, <1 мкл),
высушивается на подложке, образуя кристаллоиды
MALDI - matrix assisted laser desorption / ionization
лазерная десорбция и ионизация в присутствии
вспомогательного вещества - матрицы

MLLTQVQTYVLSIIPSGPLKAEIAQRLEDVFAGKNTDLEVLMEWLKTRPILSPLTKGILGFVFTLTVPSERGLQRRRFVQNALNGNGDPNNMDKAVKLYRKLKREITFHGAKEISLSYSAGALASCMGLIYNRMGAVTTEVAFGLVCATCEQIADSQHRSHRQMVTTTNPLIRHENRMVLASTTAKAMEQMAGSSEQAAEAMEVASQARQMVQAMRTIGTHPSSSAGLKNDLLENLQAYQKRMGVQMQRFK
Пример MALDI масс-спектра:
триптический гидролизат фрагмента белка М1 вируса гриппа

Точный механизм MALDI ионизации неизвестен,
однако в результате образуются, как правило,
однозарядные ионы, захватившие протон
либо иной катион.
MALDI : типы положительных ионов и вид спектра

Пептид массой 2000 Д содержит ~ 100 углеродов
в нем с вероятностью ~ 30% не встретится 13С,
с вероятностью ~ 50% встретится один 13С,
с вероятностью ~ 20% встретится два 13С.
NB: в масс-спектре детектируется 103 – 106 молекул аналита.
Этого достаточно для наблюдения изотопного рапределения.
Моноизотопная масса – масса пептида, не содержащего ни одного13С
вид MALDI
масс-спектра
вид ESI
масс-спектра
моноизотопнная
масса
средняя (average)
масса
Естественное изотопное распределение
в белках и пептидах

* Оба метода ионизации требуют высокой химической чистоты
анализируемого вещества.
* Диапазон концентрации аналита при ESI и MALDI 10-3 – 10-7 M.
* Поскольку разные вещества (например, пептиды) обладают разной
способностью к ионизации (захвату протона либо другого катиона),
то невозможно делать выводы о количественном соотношении
компонентов сложной смеси на основании высот пиков в спектре.
При ESI образуется непрерывный поток ионов,
при MALDI - сильно ограниченный во времени (до 10нс) пакет ионов.
При ESI анализу подлежит более 10 фемтомолей вещества,
при MALDI - более 1 фемтомоля вещества.
При ESI образуются ионы m/z 0-5000,
возможно измерение белков до ~50 000 Да.
При MALDI возможно измерение белков до ~200 000 Да,
диапазон измеряемых масс ограничен снизу до ~500 Да
из-за присутсвия с спектрах пиков матрицы.
ESI является более “мягким” способом ионизации, чем MALDI.
Замечания о ESI и MALDI:

Квадрупольный анализатор
Ионная ловушка
Магнитный анализатор
Времяпролетный масс-анализатор
СИСТЕМЫ РАЗДЕЛЕНИЯ ИОНОВ

Микроканальные пластины
При MALDI существует разброс по энергиям,
приводящий к уширению пиков.
Энергия ускорения 20 кэВ и длина пути 1м
При энергии ускорения 20 кэВ разброс в 100эВ
составляет 0.5%.
Так пик пептида м.в. 1000Д имел бы ширину
на половине высоте около 2 Да !
MALDI-времяпролетный масс-спектрометр
с MCP детектором

Использование отражающего напряжения (рефлектрона Мамырина)
Использование «отсрочки экстракции»
вакуум
Уменьшение стартового разброса ионов –
повышение разрешения MALDI-TOF-MS

Разрешение до 30 000,
точность до 0.002% (=20ppm).
Разрешение и точность MALDI-TOF-MS

Когда ион, захвативший избыток энергии в процессе MALDI,
распадается в области свободного дрейфа, фрагменты имеют
ту же скорость, что и их родительский ион, а энергию - меньшую (~ m)
Распад ионов в процессе MALDI

для адекватного отражения дочерних ионов: U1ref/U0ref = m1/m0
набор масс-спектров с разным U рефлектрона
компьютерно “сшиваются” в один спектр PSD
получается один спектр фрагментации TOF-TOF
точность измерения масс фрагментов 0.02-0.1%
PSD (post source decay) и TOF-TOF
детекция распада ионов во время свободного дрейфа

На верхний и нижний электроды подано постоянное положительное напряжение.
На короткое время отталкивающее напряжение с верхнего электрода снимается, позволяя пакету ионов влететь в ловушку.
На центральном электроде -быстропеременное напряжение,
которое заставляет ионы всех m/z двигаться со своими частотами по своим орбитам.
Затем, на экстрагирующие линзы подается осцилируещее напряжение, последовательно вытягивающее ионы согласно их m/z.
Характеристиками ловушки являются:
ёмкость (верхнее значение разделяемых m/z ) до 4000,
разрешение до 0.2 Да по диапазону,
точность до 0.01% (=100ppm) для родительских ионов и фрагментов.
Ионные ловушки позволяют, варьируя напряжения, оставлять в ловушке определенные ионы и получать спектры их фрагментов.
При этом возможен ряд последовательных фрагментаций иона.
Ионная ловушка хорошо сочетается с жидкостным хроматографом.
ESI – ионная ловушка с МСР детектором

Сочетает хорошее разрешение времяпролетного масс-спектрометра с возможностью хорошего выделения (включением квадруполя) определенных ионов для получения спектров фрагментации.
На электроды квадруполя подается переменное напряжение, позволяющее пролетать только резонансным ионам.
Напуск инертного газа приводит
к столкновительной фрагментации ионов.
точность 0.01-0.03% для родительских ионов и фрагментов
«Гибридные» приборы:
ESI – квадруполь – ортогональный времяпролетный МС

Ионы «запираются» в мощный (7-14 тесла)
секторный сверхпроводящий магнит,
где вращаются под действием силы Лоренца
с частотой, зависящей от m/z.
Два сектора магнита используются для снятия токов, наведенных пролетающими мимо них ионами.
Сложный сигнал от ионов разных m/z
подлежит разложению по частотам
(Фурье-преобразованию).
Характеристики ICR-FT :
разрешение до 10 000 000,
точность до 0.0001% (=1ppm).
ESI - масс-спектрометры ионно-циклотронног резонанса
с последующим Фурье- преобразованием (ICR-FT)

Сравнение характеристик приборов