Методика выявления нуклеиновых кислот

Гібридизація in situ (ГІС)
- Це метод прямого виявлення нуклеїнових кислот у клітинних структурах в умовах, що дозволяють одночасно досліджувати і їх морфологію.
Використовують для:
Картування геномів
Виявлення хромосомних перебудов
Виявлення поліморфізму ДНК
Визначення статі
Внутрішньоклітинної локалізації мРНК
Хромосомної локалізації унікальних генів.

Метод розробили Пардью і Голл в 1969 р. (для вірусів) з використанням - мічених зондів для:
Виявлення вірусних нуклеїнових кислот в інтерфазному ядрі
Хромосомоспецифічних копій
Локалізації специфічних мРНК
Транслокацій

Картовано чимало генів людини:
- Ген легкого ланцюга імуноглобуліну Χ (IGK)
Гени гістонів (Н1, Н2А, Н2В, Н3, Н4)
Гени інтерферонів α і ß (IFL, IFF)
Ген інсуліну (INS)
Кластер генів гормону росту (GH)
та ін.

Вибір методики
Залежить від наступних факторів:
Природи нуклеїнової кислоти-мішені.
Чутливості.
Специфічності.
вартість, безпечність, наявність реактивів та обладнання.

Денатурація ДНК-зонда та ДНК-мішені
Змішування ланцюгів ДНК-зонда та ДНК-мішені
Якщо в ДНК-мішені є послідовності, комплементарні до ДНК-зонду, то утворюються молекулярні гібриди, які можна виявити завдяки мітці
Принцип утворення ДНК-ДНК гібридів

Методики визначення РНК і ДНК за допомогою ГІС відрізняються, оскільки різниця є у всіх етапах –від отримання клітин і тканин до способу детекції.
Чутливість залежить від мішені, яку необхідно визначити, наприклад, для епідеміологічних досліджень латентних вірусних інфекцій метод має бути високочутливим, а для визначення багато повторюваної послідовності – малочутливим.
Чутливість методу залежить від особливості всіх етапів, від фіксації препарату до вибору фермента для детекції.

Принцип гібридизації in situ

Мітки та їх детекція

Зонд і його мічення
Дволанцюгові ДНК-зонди
Використовуються для виявлення ДНК, проте також використовуються і для гібридизації РНК. Представляють собою бактеріальні плазміди із вбудованою специфічною послідовністю.
а) нік-трансляція;
б) метод розсіяної затравки;
в) ПЛР.

Метод нік-трансляції

Зонди
Одноланцюгові ДНК-зонди
Одноланцюгові РНК-зонди
Олігонуклеотидні зонди
Зонди, отримані за допомогою ПЛР

Олігонуклеотидні зонди
1) з чітко вираженою послідовністю (19 - 40 нуклеотидів);
2) з сильно виродженими послідовностями (17 - 20 нуклеотидів);
3) з менше виродженими послідовностями (30 – 70 нуклеотидів).

Фіксація препаратів і підготовка предметних скелець.
Попередня обробка зрізів включає:
-депарафінування зрізів тканин, залитих в парафін;
-демаскування нуклеїнової кислоти-мішені;
-обробка ДНКазою або РНКазою;
-передгібридизація зрізів.

Зразки
1) мазки (фіксують в р-ні Карнуа);
2) виготовлені шляхом центрифугування;
3) біоптати:
а) парафінові зрізи (фіксують в параформальдегіді);
б) кріостатні зрізи (фіксують у формаліні, р-ні Боуена, ф-рі Періодат Na – лізин-параформальдегід-глутаральдегід).

Денатурація та гібридизація.
Необхідність денатурації визначається типом зонду і нуклеїнової кислоти-мішені.
Гібридизація і визначення умов жорсткості.
Тm = 81,5 + 16,6 log M + 0,41 (%GC) – 0,72F – 650 / L
L - довжина пар нуклеотидів.
M – концентрація моновалентних катіонів.
F – вміст у реакційній суміші формаміду.

У випадку гібридів з неправильно спареними нуклеотидами необхідно відкорегувати формулу. Ступінь ренатурації залежить від умов гібридизації і відмивки зразка.
Температура плавлення незавершених дуплексів (Т΄m) нижча Тm повністю комплементарних гібридів:
Т΄m = Тm –α ( % некомплементарних нуклеотидів)

Відмивка зразків після гібридизації і інгібування ендогенної ферментативної активності
Зразок відмивають після гібридизації для того, щоб:
Видалити негібридизовані зонди.
Блокувати неспецифічно зв’язані антитіла і неспецифічну ферментативну активність.
Зробити умови гібридизації жорсткими.

FISH.
Практичне значення
Визначення змін кількості хромосом.
Визначення статі дитини.
Для діагностики захворювань та підтвердження діагнозу.
Для детекції перебудов хромосом: делецій, дуплікацій, транслокацій, мікроперебудов.
Для моніторингу залишкових явищ онкозахворювання після хіміотерапії і пересадки кісткового мозку.
Для детекції скорочення хромосом.
Матеріалом для дослідження є кров, кістковий мозок, біопсія пухлин, плацента, ембріональні тканини, амніотична рідина.
Дозволяє одночасно аналізувати більше 500 клітин.

FISH-метод
Використовується для виявлення ДНК, РНК та білків у клітині або in situ.
Суть методу: якщо у пробі наявна досліджувана ділянка, комплементарна міченому флюоресцентною міткою зонду (60-200 kb), то проходить гібридизація, і мітка проявляється у флуоресцентному мікроскопі.
Дає змогу виявляти делеції та дуплікації хромосом (проявляється менша чи більша кількість міток, порівняно з контролем).

FISH
Використовують три типи зондів:
Зонди на всю хромосому;
Зонди до центромер;
Зонди до конкретного локусу хромосоми.

Для FISH методу використовують такі типи зондів:
Локус-специфічні, зв’язуються з відповідними ділянками хромосом. Дані зонди використовуються для ідентифікації певної короткої послідовності нуклеїнової кислоти.
Альфоїдні або центромерні зонди-повтори, до послідовності центромерних ділянок хромосом. З їх допомогою кожна хромосома може бути зафарбована в певний колір, що дозволяє швидко визначити число хромосом і відхилення від цього числа

Зонди на всю хромосому - набір невеликих зондів до окремих ділянок хромосоми, але в цілому вони перекривають всю хромосому. Використовуючи бібліотеку таких зондів, можна “розкрити” всю хромосому і одержати диференційний спектральний каріотип індивіда. Використовується для аналізу хромосомних транслокацій, коли фрагмент однієї хромосоми переноситься на плече іншої.
Теломерні зонди, використовують для детекції невеликих делецій, які неможливо візуалізувати при каріотипуванні

Флуоресценцію збуджують лазерними променями
Довжина хвилі максимальної емісії флуоресценції відрізняється для різних сполук
Різні типи нуклеотидів мітять різними мітками і випромінюють світло з різною довжиною хвилі (різного кольору)
Флуоресцентні мітки ДНК

FISH-метод
Транслокації виявляються з використанням різнокольорових міток, комплементарних до ділянок кожної хромосоми, по якій відбулась транслокація.Транслокована хромосома містить дві мітки (свою і хромосоми, елемент якої одержала). Недолік – мітка може зв’язатися з нетранслокованою хромосомою, що знаходиться поряд із досліджуваною. Інший метод – використання двох міток, розділених неміченим фрагментом. Транслокована хромосома містить “розрив” між мітками.

ОБМЕЖЕННЯ FISH
обмежується діагнозом на рівні хромосом, а не на рівні одного гена;
втрата ядер при виготовленні препаратів бластомерів.

Для визначення статі в поодиноких клітинах, детекції анеуплоїдій і дефектів окремих генів є методи PRINS та флюоресцентний ПЛР-аналіз.
PRINS-метод – подібний до FISH, але не потребує попереднього мічення зонду, оскільки реакція мічення відбувається in situ.

Модифікації FISH-методу
метод зворотного мічення (reverse painting);
метод порівняльної геномної гібридизації (CGH);
спектроскопічний аналіз хромосом (багатоколірне спектральне каріотипування – multicolor spectral karyotyping, SKY).

Порівняльна геномна гібридизація (CGH-comparative genomic hybridization)
Базується на порівнянні тестованої та нормальної ДНК, мічених різними флюорохромами, які змішуються в пропорції 1:1 та гібридизуються на метафазних хромосомах каріотипово здорової людини. Потім знімається серія зображень одного і того ж поля зору з використанням різних фільтрів.
ПЕРЕВАГИ:
не залежить від джерела досліджуваного матеріалу і може бути проведена з невеликою кількістю ДНК, включаючи архівний матеріал;
можна провести повний аналіз структурних аномалій в хромосомах всього геному за один раз;
не потребує виготовлення препаратів метафазних хромосом з досліджуваної тканини.
aCGH- проведення методу на чіпах (використовується при проведення ЕКЗ)

Multi-FISH фарбування і схема використання трьох барвників і їхніх комбінацій дає можливість отримати сім кольорів
FISH-метод

а) M-FISН-фарбування хромосом людини - 5 флуорохромів дали 24 кольори ;
b) SKY – мічені зонди хромосом людини використали для ідентифікації хромосом орангутанга;
с) M-FISH фарбування хромосом миші (8 і 11 хромосоми – трисоміки).
M-FISH I SKY- фарбування
Використовуючи 5 різних барвників, можна проводити спектральне каріотипування, що дозволяє відрізнити кожну з 23 пар хромосом. Застосовується для виявлення аномалій, які ушкоджують структуру багатьох хзромосом (наприклад, у ракових клітинах).

FISH – метод забарвлення хромосом: за і проти