Минеральное питание

Поступление в клетку.
Перенос через плазмалемму.
Электрофизиологический подход
Кинетический подход
Молекулярно биологический подход

Электрофизиологический подход
Потенциал Нернста может быть использован, чтобы установить тип транспорта: активный или пасивный?
μ = μ0 + RTlna + zFE
μ - электрохимический потенциал

Потенциал Нернста – градиент электрического потециала на мембране, уравновешенный градиентом химического потенциала для данного иона по обе стороны мембраны
+++
- - -
μoutK
μinK
μoutK = μ0K + RTlnaoutK + zFEout
μinK = μ0K + RTlnainK + zFEin
F(Eout – Ein) = RTln aout/ain
Δ E = RT/F ln aout/ain
Δ E = EN

Электрофизиологический подход позволяет предсказать тип транспорта
Пассивный транспорт – движение иона через мембрану в сторону его меньшего электрохимического потенциала.
Активный транспорт - перемещение иона через мембрану в сторону его более высокого электрохимического потенциала.

Сравнение наблюдаемых и предсказанных равновесных концентраций ионов в тканях корней гороха (мМ L-1), мембранный потенциал
–110 mV (Plant Physiol (book), 1998, p. 130 из Higinbotham et al., 1967 г.).
,Со)
Концентрация (Сi)
рассчитанная
измеренная

Пассивный транспорт – движение иона через мембрану по градиенту его электрохимического потенциала.
Активный транспорт - перемещение иона через мембрану против его электрохимического потенциала.

Пассивный ионный транспорт по каналу.
Ионные каналы – интегральные мембранные белки, образующие «пору» в мембране
Транспорт иона по каналу зависит от
потенциала на мембране
концентрации иона по обе стороны мб
свойств канального белка
сигнала эндогенной природы
ФР под ред. И.П. Ермакова, с. 330 - 334

Наружный раствор
Устье
Цитозоль
Ворота (gate)
+
+
+
+
+
+
+
+
(-)
(-)
(-)
(-)
(-)
Заряды гликопро-теинов
(-)
Селективный фильтр
α-субъединица
+
+
+
+
+
(-)
(-)
(-)
(-)
Сенсор
Мембрана
Гидрофильная пора
Модель потенциал - зависимого ионного канала.

Воротный механизм «работы» канальных белков
Два дискретных состояния канального белка:
канал открыт/канал закрыт

4 типа белков К+ каналов
1999
кл. дрожжей (8)
кл. животных и растений (2)
кл. животных и растений (4)
кл. животных и растений (6)
Sabine Zimmermann* and Herve Sentenac†
«Plant ion channels: from molecular structures to physiological functions»
Current Opinion in Plant Biology 1999, 2:477–482

Новые типы белков К+ каналов у растений
июнь, 1999
Впервые о двупоровых К каналах у растений было сообщено в 1997 г. (Czempinski et al., 1997)

S1
S2
S3
S4
S5
S6
H5(Р)
N-
конец
C-конец
А
+
+
+
+ +
+
+
Цитозоль
цНМФ
КНА
Рис. 2.2.2.3.4. Структура калиевого канала Shaker-типа. (А) Трансмембранная топология полипептидной цепи: S1-S6 – трансмембранные сегменты; S4 – сенсорный участок; Н5(Р) – гидрофильная петля; мяч – участок с NH3-концевой группой; цНМФ – домен С конца, связывающий циклический нуклеотид (например, цГМФ); КНА – домен, обогащенный гидрофобными и кислотными остатками. (Б) Тетрамер из четырех α субъединиц (вид сверху). (В) Модель тетрамера: стабилизация с помощью КНА-домена. (Г) – схема активации / инактивации К+-канала Shaker-типа по модели «мяч на цепи»: R (rest) – состояние покоя, O (open) – открытое состояние, I – инактивационное состояние.
Мяч
Структура калиевого канала Shaker-типа

К+-каналы Шейкерного типа у растений:
5 семейств по гомологии аминокислотных последовательностей
Филогенетическое древо К-каналов Шейкерного типа у растений (модифицировано по Ache et al., 2000 ).
1
2
3
4
5
AKT1 – Arabidopsis thaliana K+ transporters
KAT1- K+ Arabidopsis thaliana transporters
AKT2/3 -
SKOR – stelar K+ outward rectifier
AtKC1 - Arabidopsis thaliana K+ channel

Расположение К+ каналов разных типов у Arabidopsis
SKOR
AKT1
KAT1
AKT2/3
Sabine Zimmermann* and Herve Sentenac† «Plant ion channels: from molecular structures to physiological functions», Current Opinion in Plant Biology 1999, 2:477–482

Ионные каналы в растительных клетках
Катионные и анионные
“Входящие” (in) и “выходящие” (out)
Селективность: специфические и неспецифические
Потенциал-зависимые и рецептороуправляемые
Быстрые и медленные

Активный транспорт
ΔрН
АТФ
РРнн
Первичный активный транспорт
Вторичный активный транспорт
Способы (или механизмы) активного поглощения различаются по формам потребляемой энергии.

Первичный активный транспорт

Н-помпы
отвечают за создание и поддержание потенциала на мембране
Н+-АТФазы плазмалеммы
Н+-АТФаза тонопласта
Пирофосфатаза тонопласта
Емб = Еэлектрогенный + Едиффузионный

Н+-АТФаза плазмалеммы Р-типа
Один большой полипептид 100 - 106 кДа
Регулируется по принципу «фосфорилирование/дефосфорилирование» по серину протенкиназами
Образует промежуточный фосфорилированный интермедиат (по аспартиловому концу фермента)
Ингибируется ванадатом (блокирует фосфорилирование по аспартиловому концу фермента)
Ингибируется DES, DCCD, сульфгидрильными реагентами
Сходна с АТФазами животных клеток: Na,K-АТФаза; H,K-АТФаза; Ca-АТФаза)
Зависит от градиента ΔμН+
К+-зависимая

Структура белка Н-АТФазы плазмалеммы
Один полипептид
100 – 106 кДа
Домен связывания Mg-АТФ
Е1 связывает Н (in)
Е2 освобождает Н (out)

В процессе работы Н+-АТФаза Р-типа подвергается фосфорилированию/дефосфорилированию, меняя при этом свою активность
неактивная
активная
суперактивная

Многомерная структура 70 кДа, 60 кДа, 16 кДа (7-10 субъединиц)
Анионзависимая (нитрат ингибирует, хлорид стимулирует)
Нечувствительна к ванадату, азиду, олигомицину
Зависит от градиента ΔμН+
Н-АТФаза тонопласта (V – типа)

Пирофосфатаза тонопласта
64 – 67 кДа
катионзависимая (стимулируется К+, ингибируется Na+, Са2+) высокоспецифична к пирофосфату
зависит от концентрации магния
зависит от градиента ΔμН+
ингибируется сульфгидрильными реагентами

Метаболическая (электрогенная) и диффузионная компоненты Емб

Са2+ -АТФазы
Са2+АТФазы принадлежат к большому кругу АТФаз Р-типа
Са2+АТФазы ПМ
Са2+АТФазы ЭР
У растений в отличие от животных Са2+АТФазы ПМ типа локализованы не только на плазмалемме, но и на эндомембранах

ABC-транспортеры
Транспортные белки, которые используют энергию гидролиза АТФ для транспорта через мембраны самых разных химических агентов
Представлены у всех оганизмов
Очень многочисленное семейство
Арабидопсис : 131 различных белков
3 основных мультисемейства:
pleiotropic drug resistance (PDR),
multidrug resistance (MDR),
multidrug resistance-associated protein (MRP)

Plant Physiol, March 2003, Vol. 131, pp. 1169-1177
UPDATE ON ATP-BINDING CASSETTE TRANSPORTERS
The ATP-Binding Cassette Transporters: Structure, Function, and Gene Family Comparison between Rice and Arabidopsis1
Michal Jasinski,2Michal Jasinski,2 Eric Ducos,2Michal Jasinski,2 Eric Ducos,2 Enrico Martinoia, and Marc Boutry* Unité de Biochimie Physiologique, Institut des Sciences de la Vie, Université catholique de Louvain, Croix du Sud 2-20, B-1348 Louvain-la-Neuve, Belgium (M.J., E.D., M.B.); and Laboratory of Molecular Plant Physiology, Institute of Plant Biology, Zurich University, CH-8008 Zurich, Switzerland (M.J., E.M.)

1.Вклад в поддержание ΔЕ на мембране.
2. Обеспечение движущей силы для пассивного и активного транспорта веществ.
3. Поддержание рН в компартментах клетки.
Функции Н+-помп

ΔЕ = Δψ + ΔрН
Размен Δψ на ΔрН
Вторичный активный транспорт
(симпорт)
Ан- Н+
Форма потребляемой энергии ΔрН

Вторичный
активный транспорт

Кинетический подход. Белки переносчики.

Зависимость поглощения ионов от их концентрации в среде сходна с кинетикой ферментативной реакции
сродство транспортного белка к переносимому иону
количество транспортного белка в мембранах
Км
Vмакс.

Кинетика поглощения ионов интактным растением
5
10
15
20
[Р] в растворе,
мкМ⋅л-1
0
20
30
10
40
Imax
½ Imax
Cmin
Kmкаж
Еn
Поступление Р (In), нМ⋅м-2⋅с-1
Imaxчистый нетто-поток
Imaxотражает число мест переноса, включая рабочую поглощающую поверхность корня

Двойная кинетика поглощения.
Переносчики
высоко и низкого сродства.

Сульфатные транспортеры
высокого сродства Sultr1 или ST1 (Km порядка 10 мкмолей)
низкого сродства Sultr2 или ST2 (Km порядка 100 мкмолей)
Нитратные транспортеры
NRT2 переносчики NO3- высокого сродства Km от 10 до 100 μМ. .
NRT1 переносчики с двойственными свойствами (с высокими и низкими Km) или переносчики низкого сродства.
Фосфатные транспортеры
Высокого сродства (PT2) (Км = 3 – 7 мкмолей)
Низкого сродства (PТ1) (Км = 50 – 330 мкмолей);

Механизм транспорта - симпорт с протоном
2Н+ ./NО3-

Вторичный активный транспорт
(Сульфатный транспортер)

Переносчики, пермеазы, портеры, транспортеры
Главное суперсемейство транспортных белков
MFS (Major Facilitating Superfamily) – 12 трансмембранных доменов:
Фосфатный, нитратный, сульфатный транспортеры

Микроэлементы: Mo, Zn, B, Cu, Mn
Структура белка транспортера микроэлементов.
ZIP семейство
MFS (Major Facilitating Superfamily):
Фосфатный, нитратный, сульфатный транспортеры
ZIP семейство: 8 трансмембранных доменов

Активное поглощение и пассивное поглощение.
Способы (или механизмы) активного поглощения различаются по формам потребляемой энергии.