Онкогенні віруси людини

Вперше вірусну природу пухлин продемонстрували:
Еритробластоз курей (Ellerman та Bang, 1908), саркома курчат (Rous, 1911);
Fujinami тa Inamoto в 1914р. показали, що віруси індукують саркоми у птахів;
Через ~30 років у 1936р. Bittner показав, що саркома мишей має вірусне походження;
1951р. – Gross відкрив перший вірус лейкозу мишей;
В 1960-і рр. розпочались масштабні дослідження в онковірусологіі .

Peyton Rouse and the cancer causing chicken virus
Rockefeller University 1912

Таксономія онкогенних вірусів
DNA viruses: paріlloma-poliomaviruses- hepadnaviruses herpesviruses adenoviruses poxviruses
RNA viruses: retroviruses flaviviruses

Віруси людей , що асоціюються з трансформацією
HPV 16, 18, 31, 33, 45 Рак шийки матки
Hepatitis B&C viruses Гепатоцелюлярна карцинома
HTLV1 Т-клітинний лейкоз дорослих
Epstein-Barr virus (HHV-4) Лімфома Беркітта
Хвороба Ходкжкіна
PTLD
Назофарингіальна карцинома
Карцинома шлунку
KSHV ( HHV-8) Герпесвірус ,
асоційований з саркомою Капоші

Як віруси трансформують клітини ?
Вірусна інфекція підвищує ризик розвитку раку
Діє як “мутаген”
Інші ко-фактори (генетичні, імунологічні, або оточуючіl) можуть бути необхідні для розвитку раку
Клітинна трансформація супроводжується персистенцією всього або частини вірусного геному та експресією обмеженого числа вірусних генів.
Вірусні онкогени експресуються як змінені нормальні клітинні гени , що задіяні в сиганьній трансдукції.

Докази вірусного походження пухлин
Присутність частини вірусного геному в пухлині та експресія деяких вірусних генів
Інфекція клітин In vitro призводить до трансформації
дослідження:
Ріст в середовищі з низьким вмістом сироватки
Ріст в напівтвердому агаровому середовищі
Ідентифікація вірусних генів , що трансформують клітини в культурі
Інфікування тваринних моделей призводить до появи пухлин
Неможливість відтворити з вірусами людей
Вакцинація захищає від утворення пухлин

Фактори, що сприяють трансформації клітин вірусами
Абортивна інфекція (переривання повного циклу репродукції)
інфекція повним інфекційним вірусом генетично резистентних клітин
інфекція дефективним вірусом пермісивних клітин
інфекція повним вірусом сприйнятливих клітин в незвичайних (непермісивних) умовах
ПРИЧИНИ:

Основні положення
Зільбер Л.О. 1945
Віруси можуть викликати пухлини у ссавців
Онкогенні віруси частіше встановлюють персистентну інфекцію у природних господарів
Фактори макроорганізму – важливі детермінанти вірус-індукованого канцерогенезу

Віруси рідко бувають повністю канцерогенними
Між первинною інфекцією та появою пухлин – тривалий латентний період
Штами вірусів мають різний онкогенний потенціал
Віруси – як прямі, так і опосередковані канцерогенні агенти
Віруси модулюють контроль росту клітин
Вірусні маркери часто присутні в клітинах пухлин
Один вірус може асоціюватись з більш, ніж з одним типом пухлин

В даний час відомо більше 150 онкогенних вірусів, які поділяються на великі групи: ДНК-і РНК-вмісні
РНК-вмісні віруси активують онкогени
ДНК-вмісні віруси нейтралізують супресори пухлинного росту

ОНКОГЕННІ РНК ВІРУСИ

Alpharetrovirus: вірус лейкозу птахів, морфологічний тип-C;
(B)Betaretrovirus:вірус раку молочних залоз мишей морфологічний тип-B;
(C) Gammaretrovirus: вірус лейкозу мишей;
(D) Deltaretrovirus: вірус лейкозу великої рогатої худоби
(E) Lentivirus: вірус імунодефіциту людини;
(F) Spumavirus

Морфологічні типи
тип А – розміром 70-75 нм, ендогенні, дефектні, мають вигляд електроннощільних шарів, що локалізуються або в середині клітин (цитоплазматичні) або в ендоплазматичному ретикулюмі (інтрацистернальні );
тип В - розміром 100-160 нм, мають ексцентрично розміщений електроннощільний нуклеокапсид, досить довгі пепломери, типовий представник - вірус раку молочних залоз мишей (MMTV);
тип С– розміром 70-80 нм, характерний центрально розміщений електроннощільний капсид, короткі пепломери. До цього типу відносять ретровіруси птахів, ссавців, рептилій, риб (ALV) та (MLV)
тип Д – морфологічно подібні з частками типу В, але різняться за складом антигенів та за біологічними властивостями. До цього типу входять віруси, виділені від приматів та з культури клітин людини (вірус Мезон-Пфайзера).

•більшість ретротранспозонів відрізняються від РВ відсутністю позаклітинної фази
• Вони мають ген env , вірусоподіні частки формуються in vivo , не інфекційні

Біологічні властивості РВ
1.Різний ступінь онкогенності для природніх хазяїв Високий - для вірусів саркоматозно-лейкозного комплексу;
помірний – для деяких лейкомогенних вірусів;
низький – для природніх та польових штамів онкогенних вірусів .
Швидкотрансформуючі ретровіруси (віруси гострих лейкозів у птахів і мишей та саркоми Рауса у курей). Надзвичайно онкогенні, викликають розвиток пухлин після короткого латентного періоду. Ці віруси мають у своєму геномі онкоген, тому в основі трансформації клітин у пухлинни лежить епігеномний механізм.
Повільнотрансформуючі ретровіруси (віруси лімфолейкозів). Викликають розвиток пухлин після тривалого латентного періоду. Ці віруси не мають у своєму складі онкогена, тому основний механізм їх трансформуючої дії - мутаційний.

Біологічні властивості РВ
2.Здатність долати тканинні, видові та класові бар’єри, що особливо притаманно вірусам типу С
3. Широка розповсюдженість серед хребетних
(в інфекційній, дефектній та інтегративній формах)
4. Активне розмноження в клітинах як правило
не супроводжується ЦПД, не мають гемаглютинуючої активності.
5. Вертикальний шлях розповсюдження,
хоч для деяких доведена горизонтильна передача (вірус лейкозу котів).

Онкогенні РНК віруси

Формування віріонів

Зворотна Транскриптаза
1970 р.
Д. Балтімор, С. Міцутані та Г. Темін виявили зворотну транскриптазу в частинках вірусів типу вірусу саркоми Рауса.

Онкогенні віруси
РНК :
Диплоїдна має cap- та poly-А
Позитивної полярності
Вірусна РНК не може транслюватись, оскільки оточена білковим капсидом.
Копіювання відбувається по шляху “негативної полярності” – ДНК
Віріон має 10 копій зворотної транскриптази (ЗТ)
Копіі РНК ідентичні

Онкогенні РНК віруси
POL: ферменти
Зворотна транскриптаза (ЗТ), РНК-аза Н
Інтеграза
Протеаза
Звичайні ретровіруси мають
3 гени:
GAG : (group antigen) внутрішні білки
ENV: глікопротеїни оболонки
ТМ SU

Вірусна РНК
Зворотна
транскриптаза
R U5
U3 R
U3 R U5
U3 R U5
Утворились LTR
POLII

Онкогенні РНК віруси
головне:
відмінність двох форм
РНК
R U5 GAG POL ENV U3 R

Для вирішення питання про природу включення геному вірусу в ДНК клітини необхідно відповісти на питання: коли, де і як відбувається ця інтеграція?
КОЛИ?
в S-фазі клітинного циклу
ДЕ?
включення відбувається в регуляторні гени
ЯКИМ ЧИНОМ ВІДБУВАЄТЬСЯ?
Зчитування інформації ДНК-залежною
РНК-полімеразою починається
з регуляторної зони і йде в напрямку
структурної

Ендонуклеаза зшиває ланцюги, при цьому втрачається по 2 нт, формується новий 3’вкорочений кінець
З”єднання 3’ кінців по фосфатам
Прорміжна щілина
Репарація щілини
LTR вірусної ДНК розпізнаються інтегразою, розрізаються та ковалентно сполучаються з випадковими послідовностями клДНК
Етапи ДНК- інтеграції

Онкогенні РНК віруси
Батьківська РНК
РНК/ДНК гібрид
Лінійний DНК/DНК дублекс
Циркулярний дублекс DНК
Інтеграція Реплікація
Транскрипція вір.РНК геном mРНК
ЗТ
Зворотна транскриптаза
інтеграза
кл РНК pol II
кл DНК pol
Кл фермети сплайсингу

Механізми клітинної трансформації ретровірусами
1) Ретровірусна трансдукція онкогену (трансдукуючі ретровіруси)
2) Активація онкогена ретровірусною інсерцією (cis-acting / нетрансдукуючі ретровіруси)
3) Онкогенез, опосередкований важливими ретровірусними білками (trans-activating / нетрансдукуючі ретровіруси з тривалою латентністю)

R U5 GAG POL ENV U3 R
Деякі Ретровіруси мають додатковий ген
“типовий ретровірус”
SRC

Вірус саркоми птахів (FSV)
R U5 dGAG FMS dENV U3 R
Вірус мієлоцитозу птахів (MC29)
R U5 dGAG MYC dENV U3 R
Вірус мієлобластозу птахів (ALV)
R U5 GAG POL MYB U3 R
Деякі РВ мають додатковий ген замість структурного

Клітинний ген має гомологію з геном, знайденим у трансформуюго вірусу
Клітинні онкогени можуть індукувати трансформацію тільки після
мутації
деяких змін в клітинному геномі
Прото-oнкогени
Протоонкогени- “С” (cell - клітина) є клітинними аналогами вірусних онкогенів, “V”- virus
J. M Bishop & H Varmus Nobel Prize 1989

вірус саркоми Рауса є результатом рекомбінацій між c-src і древнім стандартним ретровірусом птахів.
функції нормальних генів і їх роль в невірусних новоутвореннях викликають підвищений інтерес дослідників.
Більшість тваринних та людських онкогенів – це змінені (мутації) форми клітинних генів (прото-онкогени= нормальний стан).
Трансформація клітинних протоокогенів в вірусні онкогени відбувається під час перебування останніх у клітинах під час фази персистенції (абортивного перебігу)

Структура дефектного РВ

Гостро трансформуючі ретровіруси
src Rous sarcoma virus Chicken
myc Avian myelocytomatosis virus Chicken
erb A, erb B Avian erythroblastosis virus Chicken
myb Avian myeloblastosis virus Chicken
ets Avian erythroblastosis virus Chicken
rel Avian reticuloendotheliosis virus Turkey
H-ras Harvey rat sarcoma virus Rat
K-ras Kirsten murine sarcoma virus Mouse
abl Abelson murine leukemia virus Mouse
raf Murine sarcoma virus Mouse
fos Mouse osteosarcoma virus Mouse
fms Feline sarcoma virus Cat
fes Feline sarcoma virus Cat
sis Simian sarcoma virus Monkey

Трансдукуючі ретровіруси
Включення клітинного прото-онкогену в вірусний геном замість кодуючих вірусних послідовностей (виняток RSV= src- oнкоген)
Супер-експресія структурно - змінених v-onc
(mos vs src)
Реплікація дефектного вірусу за допомогою помічника (helper virus)
cell
Host DNA

Наслідки ретровірусної трансдукції
“Простий удар” канцерогенезу (одна подія)
Поліклональна : пухлинний ріст починається в кожній інфікованій клітині
Пухлини утворюються протягом декількох днів
Характерно для ретровірусів тварин

Retroviruses and cancer

Білкові продукти прото-онкогенів та онкогенів:
~100 різних онкогенів ідентифіковано.
Всі відомі прото-онкогени залучені в позитивному контролі клітинного росту та поділу.
Два класи:
Фактори росту регулюють гени контролю за клітинним розмноженням.
Протеїн - кінази фосфорилюють білки-мішені, які залучені в шляху трансдукції сигналу.

Характеристика вірусних онкогенів (Virology 2000)

Трансдуковні гени – це гени сигнального шляху
Зовнішні сигнальні молекули або фактори росту (sis)
Клітинні рецептори (erbB, fms, kit)
Вторинні месенжери сигнального каскаду (kinases: src, abl, fgr, yes; mos raf)
Фактори транскрипції (jun, fos, myc, myb, ets, rel)

Будова та локалізація pp60-src

Активація src-гену

SRC
Окисний
стрес
Мітоз
ФР
АГ
Цитокіни
Позаклітинний
матрикс
Мітотичні
функції
Стрес.
механізм
RAS
MYC
Реорганізація
цитоскелету

C-SRC V-SRC

Структурна зміна в онкогені
PP
PP
P
c-Erb B (EGFR) v-Erb B
Змінений v-Erb B діє як постійно активований EGF-R
Рецептор епідермального фактору росту
Трансдукована версія
membrane

Мутації протоонкогенів Ras
характерні для пухлин людини
Мутації в кодонах 12, 13, 61 генів K-RAS, N-RAS, H-RAS
виявляються в:
60-80% випадків раку підшлункової залози;
25-40% випадків - раку легень, товстого кишечника,
щитоподібнох залози.

Мутації протоонкогенів Ras викликають перманентну
стимуляцію розмноження неопластичних клітин
Ras
Ras
ГДФ
ГТФ
SOS
GAP
Ras
Ras
ГДФ
ГТФ
Мутації в кодонах 12,13,61: Квантова (“порційна”)
стимуляція розмноження
Неактивний
Активний
Перманентна стимуляція
розмноження
(самодостатність
в проліфератиних сигналах)
Неактивний
Активний

1. Sis – фактор росту тромбоцитів (PDGF) cДНК диких мавп та котів викликає саркому
Трансформовані клітини SSV
PDGF receptor
Sis білок
проліферація

інтегрини
(a5b1 и др)
Рецептори
мітогенів/мотогенів
(Met.)
PI3K
Raf
ERK
Rho
Ras
MEK
Rac
PAK
MEKK
JNK
Фактори транскрипції
(Jun, Fos, SRF и др.)
p21Cip1/Waf1 p27Kip1
Вхід в S
Цитоскелет/локомоція
Сигнальні шляхи, що стимулюють проліферацію,
активують рух клітин
PKB/Akt
MLC
Rac
Arp2/3
Rho

За функціональною активністю онкогени можна розділити на групи
1.а) з тирозинкіназною активністю : abl, erb B, fgr, fms/fes, src;
1.б) з серинкіназною активністю: mos, raf/mil;
2) з GTP-зв’язуючою активністю: H-ras, K-ras;
3) зв’язуються з ядерною ДНК: erb A, jun, fos, myb, myc;
4) слугуть ростовими факторами: sis;
5) слугують рецепторами для лігандів: erb A для тиреоїдного гормона ТЗ, erb B для EGF, fms для CSF-1R.

Онкогени як сигнали трансдукції
Фактор росту
v-sis, int-1, int-2, hst, fgf-5
Рецептори фактору росту
v-erb-B, v-fms, v-kit, v-ros,
Сигнальні молекули
v-ras,, v-src, v-raf/mil, v-abl, v-mos, v-crk
Tранскрипційні фактори
v-ets, v-myc, v-myb, v-rel, v-ski, v-erb-A
цитоплазма

Існує три гіпотези щодо можливих механізмів неопластичного перетворення клітин за допомогою онкогенів:
-«кількісна» - збільшення кількості якісно незміненого білкового продукту онкогена
-«якісна» - якісні зміни продукту онкогена
-втрата клітиноспецифічной та часової регуляції експресії протоонкогена (Науменко О.И.1992)

Механізми клітинної трансформації ретровірусами
1) Ретровірусна трансдукція онкогену (трансдукуючі ретровіруси)
2) Активація онкогена ретровірусною інсерцією (cis-acting / нетрансдукуючі ретровіруси)
3)Онкогенез, опосередкований важливими ретровірусними білками (trans-activating / нетрансдукуючі ретровіруси з тривалою латентністю)

Cis-активуючі ретровіруси
Не мають онкогена
Зберігають всі вірусні гени
Компетентні за реплікацією

Повільно трансформуючі (хронічно) ретровіруси викликають пухлини протягом тривалого латентного періоду
Немає онкогена! – Яким чином утворюється пухлина?

Пухлина походить з однієї клітини - моноклональна
ALV може інтегруватись в геном клітини БAГАТЬОХ місцях
Але пухлина буде утворюватись тільки в ПЕВНИХ сайтах

Чи специфічні ці сайти?
Вірус Myelocytoma виділений від різних птахів завжди знаходять в одному й тому ж місці
Він завжди поруч
C-myc!
Онкогенез підсилюється інсерцією

Як C-onc залучаються в не вірусний канцерогенез?

From L. J. Kleinsmith, Principles of Cancer Biology. Copyright (c) 2006 Pearson Benjamin Cummings.

Протоонкогени та перебудова хромомсом
Лімфома Беркітта t(8;14), t(8;22), t(2;8) - мішень c-myc.
інсерція промотора Ig тяжкого ланцюгу t(8;14)
інсерція промотора лямбда легкого ланцюгу t(8;22)
інсерція енхансера kappa легкого ланцюгу t(2;8)
c-myc та c-ras ампліфікуються в різноманітних пухлинах.
int-2 aмпліфікується в первинних карциномах молочної залози.
за допомогою техніки позиціонального клонування було ідентифіковано багато онкогенів. Гостра мієлогенна лейкемія t(8:21), inv 16 мітить Core binding factor (CBF).

Механізм клітинної трансфорації cis-активуючих ретровірусів
Випадкова ретровірусна інтеграція в клітинний геном
Інсерційна активація (або дезактивація) с-onc
Cis активація з промотору або енхансеру інсерцією поблизу прото-онкогену
ALV

Наслідки активації онкогену при інсерції Ретровірусів
Клітинна трансформація відбувається завдяки інсерції поблизу потенційного онкогена
Пухлини моноклональні: провірусні послідовності інтегруються в певні хромосомні ділянки
Пухлини індукуються тривалий час (місяці). Пухлини утворюються з подібних клітин

Механізми клітинної трансформації ретровірусами
1) Ретровірусна трансдукція онкогену (трансдукуючі ретровіруси)
2) Активація онкогена ретровірусною інсерцією (cis-acting / нетрансдукуючі ретровіруси)
3)Онкогенез, опосередкований важливими ретровірусними білками (trans-activating / нетрансдукуючі ретровіруси з тривалою латентністю)

Human T cell Leukemia Virus type I (HTLV-I)
Асоційований з 2 фатальними хворобами людей
Т-клітинний лейкоз дорослих -Adult T cell leukemia (ATL)
Клональна трансформація інфікованих зрілих СД4 Т-клітин
Тропічний спастичний параперез/HTLV-1 асоційована мієлопатія
Нейродегенеративне захворювання
Ендемічне захворювання в районах Японії, Південної Америки, Африки та Карибського басейну
В світі приблизно 10-20 млн людей інфіковано
Безсисмптомне захворювання у більшості людей,
2-5% випадків захворювання проявляється через 20-40 років після інфікування.
Тривалий латентний період та низький % розвитку лейкемії підтверджує, що трансформація Т-клітин відбувається після серії додаткових ушкоджень клітини та мутацій.
Інфікує первинні CD4+ T клітини.

HTLV-I та ATL
1980 Галло ізолював тип C retrovirus (HTLV1) від хворого з “різкою T клітинною лімфомою”
Провірус присутній у всіх випадках ATL
Інтегрований вірус знаходять в клітинах пухлин ATL (monoclonal).
Сайти інтеграції варіюють у різних пацієнтів
Інтеграція не впливає на активацію c-onc

Міжклітинний контакт
Статевий (60% від чоловіка до жінки проти 1% від жінки до чоловіка)
Продуктами крові (до 1988)
Від матері до дитини ( 20% дітей від серопозитивних матерів отримують вірус)
Передача HTLV 1

Онкогенез, опосередкований важливим ретровірусним білком
Виключення з парадігми ретровірусного онкогенезу (HTLV-1)
HTLV-1 не має послідовностей клітинного походження та не впливає на клітинні онгогени ( немає cis-aктивації)
В онкогенез HTLV-1 залучений неструктурний регуляторний білок (Tax)
Tax необхідний для вірусної реплікації
Atypical flower cells of ATL

HTLV-I genome
9 kilobase РНК геном
Унікальні регуляторні білки Tax та Rev
Важливі для вірусної реплікації
Функція – експресія вірусного геному
LTR
LTR
gag
pol
env
tax
reх
pro

Tax тa Oнкогенез
Tax необхідний для вірусної реплікації
40kda фосфопротеїн
Tранскрипційний активатор геному HTLV-I
Взаємодія з вірусним LTR драматично активує експресію вірусного гену разом з клітинним фактором
Взаємодія з клітинним транскрипційним фактором та сигнальними молекулами посилює чи репресує експресію клітинного гена
Tax може трансформувати фібробласти в культурі при ко-експресії ras
У Tax-трансгенних мишей утворюються пухлини

Tax – множинний трансактиватор
Зв”язування з клітинними транскрипційними факторами посилює їх взаємодію з клітинними промоторами
Дисоціює комплекс NF-κB/IκB
Підсилює регуляцію
IL-2, IL-2 рецептор α, IL-1, IL-3, IL-6, GM-CSF, ФРТ (platelet-derived growth factor), ФНП (tumor growth factorβ1, MHC class I, c-myc, c-fos,
білку, спорідненого з паратиреоїдним гормоном

Білки регулятори клітинного циклу – мішені дії Tax
Iнактивація p53 (G1/S контроль рестрикції)
Активує циклін D, cdk2, 4 та 6, які фосфорилюють рRb , індукуючи перехід G1/S
Зв”язуючись з MAD1 (mitotic arrest-defective protein), інтерферує з G2/M фазою клітинного циклу прогресії, хромосомною сегрегацією , та пост-мітотичним ядерним асамблюванням

Tax репресує DНК -репарацію
Репресія DНК pol β , яка залучена в репарацію основ та нуклеотидів ДНК
В лімфоцитах , трансформованих HTLV-I виявляють широкий спектр хромосомних аберрацій, перестановок, дублікацій та еуплоїдії.
Tax
↑ ТФ
протоонкогени
↓ ДНК-репар
апоптоз
↓ p53
CBP/p300
p18INK4c
↑ прогресія
кл циклу

Механізми клітинної трансформації ретровірусами

Онкогенні
РНК- віруси