Полимеразная цепная реакция(ПЦР)

Полимеразная цепная реакция
это эффективный способ получения in vitro
большого числа копий специфических
нуклеотидных последовательностей

ПЦР проводят в амплификаторе — приборе, обеспечивающем периодическое охлаждение и нагревание пробирок, обычно с точностью не менее 0,1 °C.
Современные амплификаторы позволяют задавать сложные программы, в том числе с возможностью «горячего старта», Touchdown ПЦР и последующего хранения амплифицированных молекул при 4 °C..
Амплификатор
нажми на картинку

Для ПЦР необходимы:
ДНК-матрица, содержащая тот участок ДНК, который требуется амплифицировать.
Два праймера, комплементарные противоположным концам разных цепей требуемого фрагмента ДНК.
Термостабильная ДНК-полимераза — фермент, который катализирует реакцию полимеризации ДНК. Полимераза для использования в ПЦР должна сохранять активность при высокой температуре длительное время, поэтому используют ферменты, выделенные из термофилов — Thermus aquaticus (Taq-полимераза), Pyrococcus furiosus (Pfu-полимераза), Pyrococcus woesei (Pwo-полимераза) и другие.
Дезоксинуклеозидтрифосфаты (dATP, dGTP, dCTP, dTTP).

ПЦР осуществляется в ходе
трехэтапного циклического процесса:
Денатурация
Ренатурация
Синтез

Денатурация
Двухцепочечную ДНК-матрицу нагревают до 94—96°C (или до 98 °C, если используется особенно термостабильная полимераза) на 0,5—2 мин., чтобы цепи ДНК разошлись.
Эта стадия называется денатурацией, так как разрушаются водородные связи между двумя цепями ДНК.
Иногда перед первым циклом (до добавления полимеразы) проводят предварительный прогрев реакционной смеси в течение 2—5 мин. для полной денатурации матрицы и праймеров. Такой приём называется горячим стартом, он позволяет снизить количество неспецифичных продуктов реакции.

Ренатурация (Отжиг)
Когда цепи разошлись, температуру понижают, чтобы праймеры могли связаться с одноцепочечной матрицей. Эта стадия называется отжигом.
Температура отжига зависит от состава праймеров и обычно выбирается на 4—5°С ниже их температуры плавления. Время стадии — 0,5—2 мин.
Неправильный выбор температуры отжига приводит либо к плохому связыванию праймеров с матрицей (при завышенной температуре), либо к связыванию в неверном месте и появлению неспецифических продуктов (при заниженной температуре).

Синтез (Элонгация)
ДНК-полимераза реплицирует матричную цепь, используя праймер в качестве затравки. Это — стадия элонгации.
Полимераза начинает синтез второй цепи от 3'-конца праймера, который связался с матрицей, и движется вдоль матрицы.
Температура элонгации зависит от полимеразы. Часто используемые полимеразы Taq и Pfu наиболее активны при 72 °C.