Серологический метод диагностики

Иммунные реакции
Иммунные реакции – это взаимодействие между Аг и Ат, реакции специфичны и обладают высокой чувствительностью.
Использование ИР:
Определение Ат в сыворотке больного (серодиагностика).
Определение Аг (серотипирование – идентификация возбудителя; обнаружение Аг в биологических жидкостях).

Типы антигенов
Корпускулярные или клеточные
Растворимые или гаптены
Молекулярные (вирусы, экстракты )

Механизм реакции Аг + Ат
I фаза специфическая – образование комплекса Аг+ Ат
Условия: специфичность эпитопа (валентность) и паратопа (авидность и аффинность).
Аффинность – сила специфического взаимодействия Ат с Аг (энергия их связи). Определяется степенью стерического (пространственного) соответствия эпитопа и паратопа. Чем > связей, тем устойчивее и продолжительнее жизнь Аг+Ат. Наиболее аффинными являются нормальные Ат.
Авидность – прочность связывания Аг и Ат. Определяется количеством паратопов у Ат (IgM).

Механизм реакции Аг + Ат
II фаза неспецифическая – видимые физические явления (выпадение в осадок, помутнение и т.д.)
Условия:
солевой состав (электролиты),
рН среды,
осмотическая плотность,
температура среды.

Реакция Аг+Ат

Реакция Аг+Ат
Схема комплекса антиген — антитело.
А — зона избытка антигена;
Б — точка эквивалентности;
В — зона избытка антител

АГ+АТ

Реакция Аг+Ат

Реакция Аг+Ат

Виды ИР
Реакции агглютинации
Реакции преципитации
Реакции с участием комплемента (РСК)
Реакции с использованием меченых компонентов (РИФ, ИФА, РИА)

Реакция агглютинации

Механизм реакции агглютинации

Виды РА
Линейная или объемная
РА на стекле
РПГА
РТГА
Реакция Кумбса
Использование:
Определение титра антител
Определение возбудителя (антигена) иммунологическая идентификация
Определение групп крови

РА на стекле

Линейная агглютинация

Реакция непрямой (пассивной) гемагглютинации – РНГА, РПГА

РПГА

РПГА

Латекс-агглютинация

Латекс-агглютинация

Реакция обратной непрямой гемагглютинации - РОНГА
Антительные эритроцитарные диагностикумы (определение антигена)
Для определения:
токсинов (ботулинический и др.)
гормонов (гонадотропный при беременности и др)
повышенной чувствительности к лекарственным препаратам

Реакция коагглютинации
Определение возбудителя с помощью стафилококков, обработанных иммунной диагностической сывороткой (сродство белка А стафилококка и Fc – фрагментов иммуноглобулинов, которые взаимодействуют с возбудителем (антигеном).
Образование хлопьев.

Реакция торможения гемагглютинации - РТГА

РТГА

РА
РА для определения групп крови
РА для определения резус-фактора
РА для определения антирезусных антител ( непрямая реакция Кумбса)- для определения неполных Ат.

Виды РП
Р кольцепреципитации
Р двойной иммунодиффузии по Оухтерлони (преципитации в агаре)
Осадочные РП
Р радиальной иммунодиффузии (реакция Манчини)
Р иммуноэлектрофореза
Р флоккуляции (по Рамону)

Реакция преципитации

Реакция двойной иммунодиффузии в геле

РП по Оухтерлони

РП в агаре

РП в агаре

Реакция радиальной иммунодиффузии (Манчини)

Иммуноэлектрофорез
Сочетание метода
электрофореза и
иммунопреципитации.
Смесь антигенов вносят в лунки геля и разделяют с помощью электрофореза.
Затем в канавку параллельно зонам электрофореза вносят сыворотку и в месте «встречи» с антигеном образуются линии преципитата.

РП
Реакция флоккуляции (по Рамону)
Для определения активности антитоксической сыворотки и анатоксина.
Иммунная электронная микроскопия – электронная микроскопия вирусов обработанных антителами (иммунными сыворотками) – микропреципитаты («венчик» из антител контрастированных фосфорно-вольфрамовой кислотой или другими электронно-оптическими прпаратами)

Реакции с участием комплемента
Реакция лизиса
Реакция связывания комплемента
Реакция радиального гемолиза
Реакция иммунного прилипания

Реакция лизиса

Реакция лизиса

РСК
1 фаза – Аг+Ат+С
2 фаза – индикаторная выявление свободного комплемента при добавлении гемолитической системы (Э+ГС)

РСК

РСК

Реакция нейтрализации
РН токсина антитоксином
РН на культуре клеток

Виды иммунных реакций

Реакции с использованием меченых Аг или Ат
Р иммунофлюоресценции (РИФ, реакция Кунса) – прямая и непрямая
Иммуноферментный анализ (ИФА)
Иммуноблотинг (сочетание электрофореза и ИФА)
Р радиоиммунного анализа (РИА)
Иммунная электронная микроскопия – микроскопия в электронном микроскопе вирусов предварительно обработанных иммунной сывороткой меченой электроннооптически плотными препаратами (ферритин).

Реакция иммунофлюоресценции

Реакция иммунофлюоресценции

Реакция иммунофлюоресценции

Реакция иммунофлюоресценции

РИФ

Иммунные реакции с мечеными Аг и Ат

РИФ

ИФА (иммуно-ферментный анализ)

ИФА

ИФА

ИФА

ИФА

ИФА

Иммунохроматография
Рис. 1. Принцип работы иммунохроматографического экспресс-теста.
1 – образец, содержащий аналит; 2 – конъюгат; 3,4 – иммобилизованные антитела (тестовая и контрольная полосы); 5 – подушечка для образца; 6 – подушечка для конъюгата; 7 – мембрана; 8 – подушечка для абсорбции реагентов; 9 – подложка для мембраны; 10 – тестовая полоса: положительный результат; 11 – контрольная полоса: достоверный результат теста.

Иммунохроматография
Исследуемый образец суспендируют в специальном буферном растворе. Надосадочная жидкость смешивается в определенной пропорции с конъюгатом – специфичными антителами, связанными с окрашенными частицами латекса.
Частицы комплекса «антиген–конъюгат» двигаются вдоль нитроцеллюлозной мембраны, в которой иммобилизованы антитела, специфичные к антигену.
Они связывают частицы движущегося комплекса, в тестовой зоне образуется видимая полоса, свидетельствующая о наличии определяемого возбудителя в образце.
Контрольная полоса, свидетельствующая о том, что миграция образца вдоль мембраны произошла нормально.
В результате анализа появляются полосы разного цвета, соответствующих присутствующему в образце возбудителю.

Иммунохроматография
Положительный результат экспресс-теста RIDA Quick Verotoxin / О157 Combi
Формат теста: вверху – тест-кассета, внизу – тест-полоска.
1 – участок внесения образца.
2 – участок расположения конъюгата.
3 – реакционная зона; слева направо – контрольная полоса (С); тестовая полоса, свидетельствующая о наличии в образце веротоксина (T2); тестовая полоса, свидетельствующая о наличии антигенов штамма O157 (T1).
4 – участок абсорбции реагентов (закрыт пленкой с названием теста).

РИА (радиоиммунный анализ)

РИА (радиоиммунный анализ)

РИА

РИА

Иммуноблотинг
Блоттинг – (Blot –пятно) основан на сочетании электрофореза и ИФА или РИА
Антиген выделяют с помощью ЭФ в геле
Переносят на активированную бумагу или нитроцеллюлозную мембрану и проявляют с помощью ИФА. (коммерческие)

Иммуноблотинг
На полоски наносят сыворотку больного
Отмывают
Наносят антисывортку меченую ферментом
Добавляют хромоген
Изменение окраски
Возможна радиография если добавляли сыворотку меченую радиоактивной меткой

Иммуноблотинг

Иммуноблотинг

Проточная цитометрия
Проточная цитометрия и сортировка – это современная технология быстрого измерения параметров клеток или клеточных компонентов, основанная на пропускании суспензии микрообъектов через зону чувствительности прибора с возможностью их последующего разделения на основе измеренных характеристик.
Использование моноклональных Ат к CD-антигенам.

Проточная цитофлюорометрия
Фенотипирование клеток с применением моноклональных антител
Изучение пролиферативной активности нормальных и опухолевых клеток на основе анализа клеточного цикла
Выявление анеуплоидных клонов и апоптозных клеток
Автоматический счет форменных элементов крови
Исследование размеров клеток
Дифференциальный анализ с подсчетом формулы крови
Выделение атипичных клеток

Достоинства
Высокая скорость анализа
Большая точность и воспроизводимость измерений
Надежность и достоверность результатов
Анализ точности измерений, сто дает возможность «контроля качества»
Большая разрешающая способность и чувствительность метода
Способность определять и анализировать ничтожно малые концентрации частиц (при тромбоцитопениях)
Применение при анализе компьютерной техники при регистрации, накоплении и хранении данных

Недостатки
Высокая стоимость аппаратуры для проточной цитометрии
Дороговизна обучения технического персонала
Отсутствие прямого визуального анализа объектов и изучения тонкой структуры клеток по сравнению с компьютерной цитофотоморфометрией фиксированных препаратов

Задачи
Подсчет и анализ клеточных элементов, редко встречающихся в популяции (стволовых клеток)
Исследование распределения клеток по стадиям клеточного цикла
Изучение анеуплоидных клеток, особенно в случаях, когда это затруднительно при помощи кариологического анализа (низкий уровень пролиферации или клетки находятся в стадии G0)
Количественная оценка экспрессии антигена
Выявление клеток по наличию 2,3 и более иммунологических маркеров
Прижизненный анализ и сортировка клеток
Быстрый анализ динамики протекания клеточных процессов в гетерогенных популяциях
Возможность препаративной сортировки, в том числе стерильной, для последующей работы с живыми клетками

Проточная цитометрия
Быстрое пропускание суспензии клеток через зону чувствительности прибора (до 30м/с с регистрацией 1000 кл/с)
Гистограмма составляется (установление шкалы интенсивности по оси абсцисс по оси ординат –число клеток с данным значением измеряемого параметра)
При измерении 2-х параметров данные представляются в виде графика в двухмерной системе координат.

Измерение клеток - методы
Кондуктометрия – капилляр диаметром 70 мкм и длиной 0,75 диаметра, с большой скоростью пропускается суспензия клеток. По обе стороны от капилляра –электроды, между которыми постоянный ток. Электрическое сопротивление клетки выше чем электролита
Радиочастотный анализ (RF –radio frequency) разновидность кондуктометрического метода на гематологических анализаторах

Измерение клеток - методы
Регистрация светорассеяния и поглощения. Светорассеяние обусловлено клеточным размером, формой, плотностью, окрашиванием и гранулярностью внутриклеточных структур.
Рассеянный свет от клеток и частиц состоит из дифракционных, рефракционных и рассеивающих компонентов.

Измерение клеток - методы

Измерение клеток - методы
Флуориметрия - измерение флюоресценции красителей, связанных с избирательными клеточными структурами.
Регистрация флуоресценции имеет преимущества:
Флуоресцентное излучение прямо пропорционально специфическим клеточным компонентам
Концентрация красителя для исследования клетки очень низкая, что минимально сказывается на жизнеспособности объекта
Нефлуоресцирующие соединения могут становиться флуоресцирующими при взаимодействии с внутриклеточными структурами или ферментами

Измерение клеток - методы
Многоцветный анализ – одновременное использование нескольких флуоресцентных меток разного цвета. Преимущества:
Экономия времени, расходных материалов и исследуемых клеток
Повышение чувствительности и информативности анализа
Снижение цены реактивов

Измерение клеток - методы
Изучение поляризации флуоресценции позволяет охарактеризовать вязкость или текучесть мембран, которое отражает функциональное состояние клетки.
При поляризации лазерного излучения флуоресцирующие молекулы излучают поляризованный свет.

Измерение клеток - методы
Анализ сигнала волновой формы (анализ формы сигнала) можно использовать для измерения ядерного и цитоплазматического диаметра. Применяется «щелевой анализ» - лазерный луч фокусируют до 1 мкм, а измеряемые клетки пересекают его с постоянной скоростью.

Измерение клеток - методы
Сортировка клеток служит для клонирования клеток а также для получения чистых суспензий клеток для последующего анализа при помощи других методов (морфологических, электронно-микроскопических, генно-инженерных и др.).