Системы регистрации взаимодействия биомолекул

колебания атомов
катализ
связывание лигандов
конформационные переходы
вращение групп
Временная шкала динамических событий в ферментах и фермент-субстратных комплексах

102
10-10
100
10-5
Время, с
Spectroscopic methods
Hand mixing
Flash and T jump
EPR and NMR
Pressure jump
Dielectric relaxation and electric dichroism
Laser scatter
Fl polarization
Ultrasound absorption and electric field jump
Stopped flow and continuous flow
Временные возможности методов исследования

Изучение исходных компонентов, продуктов, их соотношений не даёт информации ни о механизме, ни о скорости реакции, ни о промежуточных соединениях
Исходные компоненты
Продукты реакции
Скорость?
Механизм?
Переходные
состояния?

В 1872 году бывший губернатор Калифорнии Леланд Стэнфорд (Leland Stanford), бизнесмен и владелец скаковых лошадей, сделал ставку в споре: все ли четыре копыта лошади отрываются от земли во время галопа .
Спор был решён с помощью «быстрой фотографии»
«Фотографии» химических процессов - методы быстрой регистрации

Eadweard Muybridge, 1878

Eadweard James Muggeridge
Edward J. Muybridge (Helios)
9 April 1830 – 8 May 1904

Методы регистрации неравновесной кинетики
в применении для физико-химической биологии
Stopped-Flow technique
Continuous flow method
Quench-Flow technique
Fast freeze quench
Temperature Jump
Pressure jump
Laser Flash Photolysis

Метод «остановленной струи»
Mechanical mixing-spectroscopic observation
Usual deadtime ~ 1 ms; time resolution is less than 1 ms

Быстрое смешивание компонентов
Спекторофотометрическая детекция

Первая аппаратура для stopped-flow
Britton Chance
(July 24, 1913 – November 16, 2010)
Chance B. The accelerated flow method for rapid reactions. Journal of the Franklin Institute. 1940. V. 229. P. 613-640. (University of Pennsylvania)
5.5 metre class

Britton Chance and his "magic machine" for studying stop-flow kinetics, 1947

Q. H. Gibson and L. Milnes. Apparatus for rapid and sensitive spectrophotometry. Biochem. J. (1964) 91 (161–170) (University of Sheffield)

Мертвое время прибора (Dead time)
Время, которое проходит между смешиванием компонентов и началом регистрации сигнала.
Обычно: 0,5 – 1,3 мс

Современное оборудование

Детекторы
UV/Vis поглощение
PDA – весь спектр за один скан
Изменение флуоресценции (флуорофоры белков/введённые флуорофоры в субстратах/введённые флуорофоры в белках)
Изменение оптического спектра
Изменения поляризации флуоресценции
Изменения в спектрах КД
Stopped-flow ЯМР

Stopped-flow ЯМР
NMR is the most information-rich type of spectroscopy
Hand-mixing of reagents –useful to get data points within tens of seconds
Stopped flow is useful to get data points within 2-10 s
Main delay in this technique is the spin-lattice relaxation time, T1
Apparatus not commercially available yet
Christianson, M. D.; Tan, E. H. P.; Landis, C. R. J. Am. Chem. Soc. 2010, 132, 11461.
Green, D. B.; Lane, J.; Wing, R. Appl. Spectrosc.1987, 41, 847.

Christianson, M. D.; Tan, E. H. P.; Landis, C. R. J. Am. Chem. Soc. 2010, 132, 11461.
Stopped-flow ЯМР

M. C. R. Shastry, S. D. Luck, H. Roder. Biophysical Journal Volume 74 May 1998 2714–2721
Метод непрерывной струи
Continuous flow

UV/Vis поглощение
Изменения в ИК-спектрах
Изменение оптического спектра
Изменения в спектрах КД
ЯМР и ЭПР-спектрометры
Детекторы для Continuous flow

Stopped flow method:
full kinetic in one experiment
needs fast detection
Needs less sample
Continuous flow method:
Full kinetic only with variable flow or movable detector
Signal can be accumulated
Needs more sample
Stopped-flow / Сontinuous flow

Quench-Flow technique

Остановка реакции
Хаотропные агенты
Детергенты
Стоп-аналоги субстратов
Щёлочи/кислоты
Высокие концентрации немеченых субстратов

Последующий анализ продуктов
Жидкостная хроматография + MS
Электрофорез
РСА
ЯМР/ЭПР

Fast freeze quench

ЯМР и ЭПР-спектроскопия
UV-Vis-, ИК- спектроскопия в «стёклах»
XAFS
Анализ промежуточных продуктов после
Fast freeze quench

Схема оборудования для freeze-quench
Verkhovskaya M L et al. PNAS 2008;105:3763-3767

Релаксационные методы

Temperature-Jump (Релаксационные методы)

Аппаратура для Temperature-Jump

Метод T-Jump позволяет регистрировать ход быстрых реакций со временем полупревращения порядка нескольких микросекунд. Реакционную смесь поддерживают в равновесии при определенной температуре, а затем вводят возмущение быстрым изменением температуры.
Нагрев обусловлен прохождением через буфер короткого импульса электрического разряда при высоком напряжении, способного индуцировать повышение температуры до 10 ° С за несколько микросекунд.
Ход реакции регистрируют спектрофотометрически по UV / VIS (поглощение и флуоресценция) с помощью детекторов с быстрым откликом

Temperature Dependence of Reaction Rates
Svante Arrhenius observed that reaction rate constants had a temperature dependence that could be expressed by the Arrhenius equation:
k = A e - Ea / (R T)
Here A is the pre-exponential factor or frequency factor and is related to frequency with which the reacting species collide. Since:
ln k = ln A - Ea / (R T)
plots of the natural logarithm of rate constant versus the inverse of the Kelvin temperature are expected to be linear

Square of reciprocal relaxation time, s ¡ 2, vs oligonucleotide concentrations for (a) (p14)¢ (ODN-14) at 49.7 ±C
(j ), 52.7 ±C (. ), and 54.7 ±C (² ) and for (b) (p14)¢ (ODN-11) at 41.7 ±C (u ), 46.7 ±C (m ), and 51.7 ±C (± ).
Koval V. et. al. IUBMB Life, 48: 317–320, 1999.

Pressure-jump
(Релаксационные методы)
Скачок давления - метод, используемый в исследовании химической кинетики. Она включает в себя быстрое изменение давления экспериментальной системы и наблюдения за возвращением к равновесию. Метод позволяет изучать смещение равновесия реакций, в диапазоне времени между от миллисекунд до нескольких часов .
Детекторы: абсорбционная или флуоресцентная спектроскопия, круговой дихроизм (CD), FTIR и ЯМР.
Чаще всего быстрое падение давления достигается с помощью использования быстрого клапана либо взрыва мембраны.

Prigozhin M B et al. PNAS 2013;110:8087-8092
Pressure-jump
The sample is pipetted into a dimple in a sapphire cube. The dimple is covered with mylar-coated aluminum foil and pressurized by pumping ethanol into a pressure fitting. A current burst into a copper electrode bursts the upper steel membrane and releases the pressure. Sample fluorescence is excited by a 280-nm pulsed laser every 12.5 ns and is collimated by a UV light guide onto a photomultiplier. The digitized raw data consist of a train of fluorescence decays, whose lifetime and intensity monitor the refolding of the sample after the sudden P-drop at t = 0.

Laser Flash Photolysis

Лазерный импульсный фотолиз является одной из самых эффективных для исследования путем прямых измерений быстропротекающих химических и биологических реакций, например, с участием свободных радикалов, ионов и веществ в возбуждённых состояниях.
Использования лазера в качестве источника возбуждающего излучения позволяет проводить исследования при чётко заданной длине волны с наносекундной развёрткой. Подобный источник излучения гарантирует высокую воспроизводимость результатов и позволяет получать спектры с разрешением по времени в рамках вышеуказанного шага.
Лазерный импульсный фотолиз находит всё более широкое применение в сфере исследования механизмов биоорганических реакций, например, изучение переноса электронов в цитохромах или связывание лигандов гемсодержащими белками. Также данный метод анализа применим для исследования конформационных изменений белков в ходе биохимических взаимодействий.

Принципиальная схема установки
для laser flash photolysis