Анализ состава гетерозиготных генотипов CYP2C19 для определения цис- и трансконфигурации

Немного о CYP450
Цитохром Р450 (CYP450) — большая группа ферментов, отвечающая за метаболизм чужеродных органических соединений и лекарственных препаратов.
•Ферменты семейства цитохрома Р450 осуществляют окислительную биотрансформацию лекарственных препаратов и ряда других эндогенных биоорганических веществ.
•Все изоформы цитохрома Р-450 объединены в семейства CYP1, CYP2, CYP3. Внутри семейств выделены подсемейства A, B, C, D, E. В пределах подсемейств изоформы обозначены порядковым номером.

•Цитохром Р450 2С19 - фермент, элемент многофункциональной системы оксидаз цитохрома P450.
•CYP2C19 участвует в метаболизме ксенобиотиков, в том числе ингибиторов протонной помпы(блокаторов Н+/К+-АТФазы париетальных клеток слизистой оболочки желудка и уменьшающих, таким образом, секрецию соляной кислоты) и противоэпилептических средств (диазепам,фенитоин, фенобарбитал).
•В человеческом организме CYP2C19
располагается в гепатоцитах.
CYP2C19

Метаболизм клопидогрела
CYP2C19 является ферментом печени, который действует на 5-10% лекарственных средств, исследованных на данный момент, в том числе на антикоагулянт - клопидогрел (плавикс), противоязвенные препараты (омепразол, пантопразол, лансопразол, рабепразол и эзомепразол), противосудорожные препараты (мефенитоин), противомалярийный прогуанил, и анксиолитические (диазепам, нордазепам, фенобарбитал).

Метаболизм ингибиторов протонной помпы

Большая часть генов CYP450 принадлежит 34 различным аллелям CYP2C19 . Треть из этих аллелей контролирует активность фермента (e.g.,*9) или его продуктов (e.g.,*2, *3, *4, *6, *7 и *8). Исключение составляет *17 аллель, которая ассоциирована с ростом транскрипционной активности.
Частота встречаемости *17 аллели меняется этнически: начинается с 3% в Азии и повышается до 21% у русских.

Фенотипы CYP2C19
Фенотипы были разбиты на четыре категории:
ультрабыстрые метаболизаторы (UM)
быстрые (EM)
средние (IM)
недостаточные (PM).
У пациентов с генотипом «быстрых» метаболизаторов отмечается быстрый метаболизм ингибиторов протонной помпы, следовательно, антисекреторный эффект от приема последних имеет у них меньшую выраженность, чем у лиц с фенотипами «промежуточных» и «медленных» метаболизаторов.

UM статус ассоциирован с увеличением активности фермента и содержал одну или две копии аллели *17. EM имели нормальную активность и имели дикий тип (*1/*1) генотипа - без мутаций (гомозиготы). IM имели среднюю активность фермента и несли одну нормально функционирующую аллель и одну аллель с потерей функции (*1) - мутация в одной аллели (гетерозиготы). PM имели низкую активность фермента и несли две аллели с потерянной функцией - мутации в обеих аллелях.

Цис-транс тест
Это генетический метод анализа, позволяющий выявить принадлежность рецессивных мутаций одному или разным генам.
Для того, чтобы две мутации, а1 и а2 могли быть исследованы с помощью цис-транс-теста, они должны оказаться в одной клетке в одной из двух возможных конфигураций по отношению друг к другу.

Организм или клетку, несущую обе мутации в цис-положении, т.е. в одной хромосоме, называют цис-гетерозиготой. Расположение этих мутаций в разных хромосомах одной пары (у эукариот) означает, что они находятся в транс-конфигурации в составе транс-гетерозиготы.

Для оценки частоты cis/trans соотношений между определенным составом мутаций гетерозигот в образцах у различных популяций, авторы разработали новый метод.
Подмножество образцов, которые имели гетерозиготный состав, были оценены для определения их гаплотипа (совокупности аллелей на локусах одной хромосомы, обычно наследуемых вместе).

Геномную ДНК образцов экстрагировали ЭДТА –антикоагулянтом из образцов цельной крови на Qiagen EZ1 BioRobot с использованием рекомендованных протоколов (Qiagen Inc., CA, USA).
Изучение CYP2C19 заключалось в двунаправленном секвенировании экзонов 1, 3, 4 и 5, или промоторов/интронов регионов: *2 (c.681G>A), *3 (c.636G>A), *4 (c.1A>G), *6 (c.395G>A, rs72552267), *7 (IVS5+2T>A, rs72558186), *8 (c.358T>A, rs41291556).
Материалы и методы. Подбор образцов

Образцы, в которых были найдены гетерозиготы для *2, *4, *11 или *17 аллелей (или были обнаружены в пределах первых 150 оснований от начала промотора , в экзоне 1 или экзоне 3) проходили дополнительную специфическую верификацию аллелей для установления cis/trans конфигурации.

Оценка гаплотипов образцов, содержащих CYP2C19 * 2, * 4 и *17
Функциональный вариант * 2 c.681G>A находится через 20 000 пар оснований от T мутации * 17 с.-806C>. Авторы оценивали ориентацию * 2 аллеля по участку с.-98T> С (rs4986894). Из-за близости от * 4 аллеля также можно было оценить * 4 и *17 аллели, используя тот же метод.

Для каждого образца две копии гена амплифицировали раздельно на сиквенс-специфической ПЦР. Один вариант содержал сиквенс спицефичский * 17 С (дикого типа) форвард (5´-AACCCTCA CTAAAGAATTT-GTGTCTTCTGTTCTCAAAGC-3´) и второй * 17 Т (мутантного типа) (5´-AA TTTGTGTCTTCT TTCTCAAAGT-3´) форвард . Реверс праймер в обоих смесях совпадал.

Обе ПЦР смеси включали: 25 ng гДНК, 0.5 μl каждый, 25 μM праймеров форвард и реверс, 5 μl 2X Failsafe Buffer D (Epicenter, WI, USA), 0.1 μl of Failsafe Enzyme mix (Epicenter) and 2.9 μl воды (Hyclone, UT, USA), общий объем смеси составлял 10. Обе реакции были проведены с использованием 9700 Thermal Cycler
ПЦР-продукты были обработаны щелочной фосфатазой и экзонуклеазами, чтобы удалить любые несвязавшихся dNTP и праймеры, прежде чем перейти на секвенированию. Из каждой ПЦР было проведено шесть реакций секвенирования из образца (из каждого образца по две). Каждая смесь для секвенирования содержала: 1 μl ПЦР продукта, 5 μl воды(Hyclone), 1 μl по 10 μM сиквенс-праймеров, 1 μl BigDye® Terminator Mix v3 (Life Technologies), и 2 μl по 5X Sequencing Buffer (Life Technologiesдо общего объема в 10 μl.

Секвенирование проводили в соответствии с BigDye® Terminator Sequencing протокола Life Technologies (Life Technologies).Последовательность праймеров были следующие: * 17 форвард 5'-ТТТ AACCCCCTAAAAAAACACG-3‘ (этот пример проверяется специфику связывания ПЦР праймера) промотер форвард 5'-GAGAACAAGACCAAA GGACATT-3'(200 оснований выше экзона 1) и промотер реверс 5'-GATATTTCCAATCACTGGGAGA GGA-3'(расположен в экзоне 1). Сиквенс хроматограммы для каждого образца анализировали с помощью Mutation Surveyor® (Soft-Genetics, LLC, PA, USA)

В дополнение, был обнаружен 31 образец (1% от общего количества), который содержал гетерозиготный * 11 аллель. Из них 29 также содержали * 2, и шесть из них содержали * 2 * 11 и * 17 (включены в предыдущий этап). Из них 26 образцов (20, из которых содержали * 2 и * 11, а шесть * 2, * 11 и * 17) мы оценивали * 2 гаплотип ОНП c.332-23A> G (rs12769205), чтобы определить ориентацию между * 2 и * 11.

Сиквенс-специфическая ПЦР проходила при тех же условиях, а смесь ПЦР включала аналогичные продукты, за исключением состава праймеров:
Форвард 5´- CCATTTCCCACTGGCTGA A AGAG -3´
Реверс 5´-ACATGAGCTAACAACCAG-GACTCCA-3´
Затем продукты ПЦР разбавляли в 1000 раз и проводили вложенную сиквен-специфическую ПЦР. ПЦР праймер*11 реферс дикого типа 5´-GTGCCAG-C A AG ATC C A ATC TAG ATC A AC TC C TC - CACAAGGCAGC-3´ и реверс мутантного типа 5´- G TG C C AG C A AG ATC C A ATC TAG A T-CAACTCCTCCACAAGGCAGT-3´. Форвард праймер 5´- GGTAGCAGGATACGACTA TCGGC-CATTTCCCACTGGCTGAAAGAG-3´ с использовался одинакового состава.

Условия ПЦР совпадали с предыдущим, разница заключалась в температурном режиме
Один образец имел в * 2, * 17 гетерозиготу c.463G> T (p.E155X; rs374036992). Из-за возможного влияния на фенотип основываясь на основе хромосомной характеристики этих аллелей, авторы разработали аллель-специфическую ПЦР. Из-за гомологии последовательностей между CYP2C19 и CYP2C9 сначала проводили ПЦР для изоляции экзона 3 CYP2C19, а затем выполняется сиквенс-специфическая вложенная ПЦР с использованием новых праймеров.