Cигналинг в овулярной фазе. Диалог гаметофитов от А до Я. Лекции 6-7

Сигнальные механизмы в пестике
Преовулярные механизмы направляют рост пыльцевой трубки к завязи.
Овулярные механизмы контролируют ее движение к семяпочке, действуя прицельно и индивидуально – каждая семяпочка «ведет» одну пыльцевую трубку.

«Центр вселенной» - АФК
Как мы помним, АФК контролируют 3 этапа прогамной фазы: собственно прорастание, рост трубки и… разрыв трубки
АФК продуцируются в ответ на сигнальные пептиды, выделяемые семяпочкой
Основными источниками АФК являются НАДФН-оксидаза плазмалеммы и ДЦ в митохондриях, но первая больше работает «на сигнал»
Относительно «новый» участник сигнальной схемы в связи с АФК - полиамины

Классика жанра - Са2+ и АФК
Фосфорилирование НАДФН-оксидазы Rboh придает ей способность связывать Са2+
Присоединение Са2+ через EF-руки запускает процесс образования АФК.
АФК активируют Са2+ каналы, увеличивается концентрация Са2+ в цитозоле.
Это приводит к активации Са2+ -зависимых протеинкиназ и амплификации сигнала фосфорилирования.

Полиамины
Полиамины являются источником АФК через полиаминоксидазу (PAO)
При прорастании на пестике, ПА активируют трансляцию запасенных транскриптов, они также выделяются в апопласт вместе с трансглутаминазой (Tgase)
ПА контролируют организацию цитоскелета, отложение КС, функции ПМЭ, ионный транспорт
ПА ингибируют РНКазы
Front. Plant Sci., 18 February 2016 | https://doi.org/10.3389/fpls.2016.00155

ПА – АФК - Ca2+
Спермидин сильно действует на пыльцевые трубки, всегда – через АФК.
Spd окисляется PAO, при этом образуется H2O2,
H2O2 активирует вход Ca2+
У pao этого не происходит, но воздействие спермидином можно имитировать путем добавления H2O2
АФК
+SPD
+SPD
SPD контроль
Aloisi et al., 2015 https://doi.org/10.1016/j.plantsci.2015.07.008

RALF4 – сигнальный пептид
RALF4 - контроль роста трубки со стороны пестика
АФК участвуют в сигнальном каскаде, который запускается в ответ на RALF4.
Воздействие RALF4 на трубки, растущие in vitro, вызывало резкое повышение уровня АФК, одновременно стимулируя рост трубок и предотвращая их разрыв.
Тушители H2O2 иодид калия и пируват натрия, наоборот, ингибировали рост пыльцевых трубок и вызывали их разрыв.

LORELEI-LIKE GPI-ANCHORED PROTEINS 2/3
Это белки, участвующие в восприятии сигнала RALF и, предположительно, входящие в рецепторный комплекс на плазмалемме трубок.
В линиях LLG2/3 RNAi уровень АФК был значительно снижен, а рост нарушен. Добавление экзогенного пероксида водорода частично восстанавливало эти нарушения
Одним из предложенных механизмов действия АФК была регуляция механических свойств клеточной стенки

Клеточные стенки мутанта llg2,3
Пектинов больше, каллозы - меньше
Нейтральные пектины
Кислые пектины

Убегание от NO? YES
Оксид азота содержится в пероксисомах ПТ и выделяется пыльцой.
Трубки «убегают» от NO in vitro

NO как сигнал от семяпочки
Нацеливание трубки на микропиле происходит с помощью NO, который образуется в узкой зоне вокруг входа.
В присутствии реагента, инактивирующего NO (cPTIO), нарушалось врастание ПТ в микропиле, трубки раздувались и лопались.
Активация тока Са2+ с помощью D-Ser частично восстанавливала нормальную морфологию пыльцевых трубок
Похоже, этот путь также зависит от Са2+

NO играет роль уже у хвойных!
Ингибиторы синтеза NO уродовали трубки
активатор делал их вытянутыми и красивыми
Флуоресценция локализована преимущественно в амилопластах!
Pinus bungeana
84 ч
100 µM cPTIO
45 µM L‐NNA
15 µM SNAP
NO synthase (NOS) inhibitor Nω-nitro-L-arginine (L-NNA)

NO и кальций у сосны
New Phytologist
Volume 182, Issue 4, pages 851-862, 31 MAR 2009 DOI: 10.1111/j.1469-8137.2009.02820.x
При «убегании» трубок лилии от источника NO сначала концентрация Ca2+ возрастала, при этом рост замедлялся и останавливался, потом был максимум, который накладывался на реориентацию и восстановление роста
У сосны подавление и активация эндогенного синтеза NO вызывали также изменение кальциевого тока и кальциевого градиента.
cPTIO
L‐NNA
SNAP

NО, актин и пектины
cPTIO
L‐NNA
SNAP
JIM5
JIM7
aniline blue
L‐NNA
L‐NNA

Teun Munnik, and Christa Testerink J. Lipid Res. 2009;50:S260-S265
Фосфолипиды: универсальный хаб
PA киназа (PAK) -липидкиназа, которой нет в клетках млекопитающих
Diacylglycerol
pyrophosphate
Plant PIP2 quantities are extremely low. PtdIns4P (PIP) is a better candidate to be the in vivo PLC substrate
InsP2
PLC would function as an attenuator of PIP and PIP2 signaling

Распределение фосфолипидов
Фосфатидная кислота сосредоточена в субапикальной плазмалемме, т.е. в зоне расположения актинового кольца.
PI(4,5)P2 локализован в плазмалемме апекса трубки.
Фосфатидная к-та - субапекс
FRAP
New Phytol. 2014 Jul;203(2):483-94. doi: 10.1111/nph.12814

Фосфолипиды и везикулярный транспорт
Экзогенная PA и ингибитор деградации PA стимулировали образование пучков актиновых филаментов, везикулярный транспорт и отложение стенки.
Подавление синтеза фосфатидной кислоты нарушало эти процессы.
PLD
diacylglycerol kinase
lipid phosphate
Front Plant Sci. 2012; 3: 54.
актин
КС
Вез.тр-т

Фосфолипиды и актин
PI(4,5)P2 может различными способами влиять на динамику актина и его связь с мембраной: непосредственно взаимодействуя с актин-связывающими белками, или опосредованно, регулируя активность и локализацию ROP ГТФаз
Киназа, катализирующая образование PI(4,5)P2, физически связана с ROP ГТФазой. Этот комплекс также локализован в кончике пыльцевой трубки.
Везикулярный транспорт

Итак, приближаемся к семяпочке
Овулярный этап разделяют на две фазы регуляции роста пыльцевой трубки:
фуникулярная и микропилярная.
Фуникулярная регуляция включает сигналы, исходящие из семяпочки, которые заставляют трубку выйти из проводникового тракта и расти к семяпочке по поверхности фуникулуса.
Микропилярная регуляция направляет трубку к микропиле и яйцевому аппарату.
Фуникулярная регуляция у Arabidopsis, как полагают, осуществляется совместными усилями спорофита и женского гаметофита.
Микропилярную регуляцию осуществляет женский гаметофит.

Фуникулярные сигналы
Природа фуникулярных сигналов, исходящих из семяпочки, неясна. В числе кандидатов рассматривают NO и D-серин, о которых мы говорили ранее, а также γ-аминомасляную кислоту (GABA)
Работа на сосне показала, что возможность такого сигналинга существовала уже у голосеменных. Использовалась ли она? Пока неизвестно…

GABA
Ингибирование глутаматдекарбоксилазы – фермента, лимитирующего скорость биосинтеза GABA, – вызывало в пыльцевой трубке дезорганизацию актинового цитоскелета, нарушения везикулярного транспорта и строительства клеточной стенки.
Как следствие, происходило подавление прорастания пыльцы и роста трубки.
Эффекты частично снимались при добавлении GABA.
Экзогенная GABA, добавленная в оптимальной концентрации, стимулировала рост пыльцевых трубок ели и табака, высокие концентрации GABA ингибировали.
Ling, Y., Chen, T., Jing, Y. et al. Planta (2013) 238: 831

Как действует GABA?
Активирует вход кальция
Регулирует экспрессию ряда генов, включая ГТФазы и ферменты липидного сигналинга
J Exp Bot. 2014 Jul; 65(12): 3235–3248.

GABA в пестике
В пестике табака обнаружен градиент концентрации GABA.
Предполагается, что секретируемая пестиком GABA активирует кальциевые каналы плазмалеммы трубки и индуцирует приток Ca2+.
Глутаматдекарбоксилаза может связываться с кальмодулином и действовать как реостат, изменяя уровень внутриклеточной GABA, а через нее и активность кальциевых каналов.
Когда пыльцевая трубка растет в зоне низких концентраций GABA, ее кальциевые каналы активируются.
Когда трубка попадает в зону высоких концентраций, GABA ингибирует эти каналы.
Глутаматдекарбоксилаза играет ключевую роль в этом процессе, обеспечивая регуляцию кальциевых каналов по типу отрицательной обратной связи.

Микропилярные сигналы
Эти сигналы имеют короткий радиус действия (100-200 мкм от микропиле), значит, здесь могут работать достаточно крупные молекулы, например, небольшие белки.
Любимый объект - Torenia fournieri, у которой «полуголый» зародышевый мешок выступает из семяпочки, так что синергиды, яйцеклетка и часть центральной клетки находятся в гнезде завязи

Микропилярные сигналы
Эксперименты с последовательной лазерной абляцией (удалением) клеток ЗМ показали, что для привлечения пыльцевой трубки к женскому гаметофиту необходимо и достаточно, чтобы сохранялась хотя бы одна синергида.
Судя по всему, синергида - главный источник хемоаттракции пыльцевых трубок

Механика врастания
В конце своего пути пыльцевая трубка замедляет рост и проникает в одну из синергид (рецептивную) через нитчатый аппарат или рядом с ним.
В синергиде рост пыльцевой трубки прекращается, она лопается, и спермии высвобождаются.

Зона взаимодействия гамет
Цитоплазмы ВК и С смешиваются
Плазмалемма С разрушается, и спермии в составе MGU перемещаются в узкое пространство между плазмалеммами яйцеклетки и ЦК.
Его обозначают как зону взаимодействия гамет.
В этой зоне, где встречаются синергиды, яйцеклетка и центральная клетка, клеточные стенки полностью или частично отсутствуют, открывая плазмалеммы

Оплодотворение
После разрыва трубки, скорость движения спермиев возрастает примерно в 100 раз.
Неизвестно, используется ли на этом этапе активный транспорт или спермии перемещаются с потоком цитоплазмы, выходящей из лопнувшей пыльцевой трубки.
После такого быстрого движения спермии останавливаются в зоне взаимодействия гамет. У Arabidopsis эта «остановка» длится около 7 мин.
В этот период дегенерирует ядро вегетативной клетки, происходит активация спермиев, адгезия плазматических мембран и объединение цитоплазмы в обеих парах гамет (плазмогамия).
После чего ядра спермиев перемещаются к ядрам женских гамет и сливаются с ними (кариогамия).

Экспрессировали в спермиях флуоресцентный белок, способный к фотоконверсии: облучение УФ сдвигало спектр флуоресценции этого белка.
Один и тот же спермий связан с вегетативным ядром на протяжении роста пыльцевой трубки.
Анализ большого числа оплодотворений показал, что «передний» спермий (связанный с вегетативным ядром), как и «задний», с равной вероятностью оплодотворяли как яйцеклетку, так и центральную клетку.
К вопросу о шансах
Curr Biol. 2011 Mar 22;21(6):497-502
http://dx.doi.org/10.1016/j.cub.2011.02.013

Одинаковые ли синергиды?
Две синергиды в зрелом зародышевом мешке многих растений неразличимы, и выбор трубкой рецептивной синергиды, по-видимому, происходит случайным образом.
Гибель рецептивной синергиды у Arabidopsis, например, запускается после непосредственного контакта с пыльцевой трубкой.
А гибель второй синергиды происходит после оплодотворения.
У других видов растений, таких как табак, рецептивная синергида определена до прибытия трубки и отличается по ультраструктуре; кроме того, в ней накапливаются значительные количества мембранно-связанного кальция

Нитчатый аппарат
Нитчатый аппарат представляет собой систему извилистых и разветвленных впячиваний клеточной стенки в цитоплазму.
Они существенно увеличивают поверхность плазмалеммы и суммарную толщину клеточной стенки.
Вблизи нитчатого аппарата концентрируются митохондрии с хорошо выраженными кристами.

Сигнальные пептиды
В числе первых аттрактантов, синтезируемых синергидами, были идентифицированы цистеин-богатые полипептиды LURE, обнаруженные у Torenia fournieri
Антисенс конструкции для пептидов LURE мешают зародышевому мешку привлечь трубки
Врастания и оплодотворения не происходит
S Okuda et al. Nature 458, 357-361 (2009) doi:10.1038/nature07882

Сигнальные пептиды
LURE (СRP) секретируются в микропилярной части женского гаметофита (в области нитчатого аппарата).
Пептиды видоспецифичны, причем пыльцевые трубки приобретают компетентность к их действию в процессе роста в столбике.
зел.- CRP пептид

S Okuda et al. Nature 458, 357-361 (2009) doi:10.1038/nature07882
Сигнальные пептиды привлекают трубки
TfCRP1=LURE1 and TfCRP3= LURE2

А у однодольных?
У кукурузы Z. Mays EGG APPARATUS 1 (ZmEA1).
Радиус его аттрагирующего действия составляет 100-150 мкм.
Транскрипты ZmEA1 накапливались перед оплодотворением, но после оплодотворения их уровень резко снижался.

Кукуруза
Флуоресцентно меченый белок EA1-GFP накапливался между стенками синергид (и поверхностью клеток нуцеллуса, расположенных вокруг микропиле.
Подавление синтеза этого пептида с помощью антисмысловой РНК блокировало процесс вхождения трубки в семяпочку.
Marton, M. L. (2005). Micropylar Pollen Tube Guidance by Egg Apparatus 1 of Maize. Science, 307(5709), 573–576.

О том же, но красиво
Синергиды являются основными источниками аттрактантов пыльцевых трубок. Они секретируют пептиды LURE, которые связываются с рецепторами LIP1/2, экспрессируемыми пыльцой, тем самым направляя рост ПТ. Транспортеры кальция участвуют в контроле роста пыльцевых трубок. На ПМ синергид высока концентрация FER и LRE, особенно в области нитчатого аппарата. При установлении связи с ПТ NTA перемещается на плазматическую мембрану за счет активности FER, вероятно, регулируемой колебаниями Ca2+ внутри синергид.

О том же, но красиво
Пыльцевая трубка лопается, когда входит за пределы нитчатого аппарата, и высвобождает спермии. Разрыв ПТ зависит от присутствия и активации FER-, LER-, NTA- и VDD-зависимых сигнальных каскадов, результатом которых является гибель рецептивной синергиды. Освободившиеся спермии расположены в зоне встречи гамет. Они связаны друг с другом, вероятно, с участием тетраспанинов.
Мужские гаметы прикрепляются к женским за счет GEX2, расположенного на их поверхности. После активации яйцеклетка секретирует EC1, что приводит к активации спермиев и локализации HAP2/GCS1 на ПМ. HAP2 / GCS1 и тетраспанины на поверхности гамет могут участвовать в слиянии мембран.

Богиня плодородия
Ключевую роль в разрыве трубки играют рецепторные киназы.
Первая РК синергиды названа в честь богини плодородия этрусков, FERONIA. Она локализована в плазмалемме в области нитчатого аппарата.
У мутантных растений fer не происходит оплодотворения. Пыльцевые трубки не могут остановить свой рост.
Семяпочка не снижает свою аттрагирующую активность и привлекает новые пыльцевые трубки.

Причем тут АФК?
Итак, FERONIA должна вызвать разрыв пыльцевой трубки, она же должна прекратить аттракцию новых пыльцевых трубок
АФК, продуцируемые NADPH-оксидазой, локализованы там же, где и FER – в нитчатом аппарате.
Развитие семяпочки дикого типа сопровождалось накоплением FER и АФК в нитчатом аппарате, достигая максимума в период готовности семяпочки принять пыльцевую трубку.
В процессе развития семяпочек мутанта Arabidopsis fer-4 уровень АФК не повышался.
DPI (ингибитор NADPH-оксидазы) и антиоксиданты эффективно снижали содержание АФК в семяпочке и блокировали разрыв пыльцевых трубок, они продолжали расти.

Сигнал на поверхности синергиды
РК FER взаимодействует с неизвестной сигнальной молекулой и запускает остановку роста трубки и активацию сигнального модуля ROP–АФК–Ca2+.
В молекуле ROP ГДФ заменяется на ГТФ, ROP-ГТФ стимулирует работу NADPH-оксидазы плазмалеммы, что приводит к увеличению уровня внеклеточных АФК в нитчатом аппарате.
АФК могут ослаблять стенку пыльцевой трубки, подготавливая ее к разрыву. Однако разрыв трубки наступает только после ее врастания в синергиду, где достигается достаточно высокая концентрация Ca2+.

Красивые имена NORTIA и LORELEI
Для NTA, как и FER, характерна полярная локализация – в нитчатом аппарате.
У мутантов nta и lre так же, как fer, пыльцевые трубки своевременно не прекращают свой рост и не высвобождают спермии
Небольшой белок LRE транспортируется в плазмалемму синергиды посредством секреторной системы и заякоривается снаружи с помощью гликозилфосфатидилинозитола – якорного домена на C-конце
LORELEI mRNA до и после оплодотворения
Plant Cell. 2008 Nov; 20(11): 3038–3049
Мутанты lorelei

Сигнальный модуль «хлеб-соль»
LRE, как и FER, индуцирует образование АФК в нитчатом аппарате
NTA перемещается в плазмалемму из цитоплазмы лишь с появлением в зародышевом мешке пыльцевой трубки.
Процесс перемещения NTA происходит под контролем FER.
LRE, наряду с FER, входит в сигнальный модуль, который включает ROP ГТФазу и обеспечивает высокий уровень АФК на входе в женский гаметофит

Оплодотворение
Двойное оплодотворение было открыто С.Г. Навашиным в конце XIX в.
Первые успешные эксперименты по оплодотворению in vitro были поставлены в начале 1990х.
Kranz с коллегами индуцировали слияние спермия и яйцеклетки кукурузы с помощью электрических импульсов.
Далее научились использовать для слияния Ca2+ , ПЭГ или даже БСА (2005)!

Гаметы и Са2+ (in vitro)
При слиянии спермия и яйцеклетки кукурузы in vitro наблюдали временное увеличение цитозольной концентрации кальция.
Кальций поступал в яйцеклетку извне. Этот процесс начинался сразу после слияния гамет в месте входа спермия.
Затем он распространялся в виде волны по поверхности яйцеклетки со скоростью около 1 мкм/с, и в итоге охватывал всю клетку
First evidence of a calcium transient in flowering plants at fertilization 1997

In vivo 2 пика
Однако позже картина усложнилась: in vivo существует 2 пика, а значит, зачем-то это нужно!
Первый пик соответствует высвобождению спермиев.
Значение этого спайка не выяснено. Он предшествует секреции белка EC1, активирующего спермии. Возможно, этот спайк связан с активацией яйцеклетки.
Второе транзиторное увеличение кальция в яйцеклетке соответствует плазмогамии.

Кальциевая подпись in vivo

А что в синергидах?
В синергиде при непосредственном контакте с ней апекса пыльцевой трубки возникали кальциевые осцилляции.
Возможно, именно эти осцилляции индуцируют гибель синергиды и разрыв трубки.
контакт
разрыв

Центральная клетка
В ЦК наблюдается один короткий пик, соответствующий выходу спермиев из трубки.
выход
пауза
плазмогамия
Denninger, P. et al. Male–female communication triggers
calcium signatures during fertilization in Arabidopsis. Nat. Commun. 5:4645 doi: 10.1038 (2014).

Mori T., (2015). Gamete Dialogs in Green Lineages. Mol. Plant. 8, 1442–1454.
«Давай сначала поговорим?...»
Диалог гамет во время «паузы»
GENERATIVE CELL SPECIFIC 1 (GCS1) у Lilium и его ортолог у Arabidopsis HAPLESS2 (HAP2) экспрессируется только в генеративной клетке и спермиях.
GCS1 – это трансмембранный белок, переносится на плазмалемму после активации!
GCS1 играет ключевую роль в слиянии спермиев с женскими гаметами
Оказалось, что адгезия мембран и их слияние – разные процессы.
Гаметы мутантных растений hap2/gcs1 успешно проходили стадию адгезии мембран, но они были не способны к слиянию

Адгезия и слияние
GAMETE EXPRESSED 2 (GEX2) экспрессируется только в спермиях.
У gex2 нарушено прикрепление спермиев к одной из женских гамет или к обеим, что не характерно для мутантов gcs1.
По-видимому, GEX2 контролирует этап адгезии гамет, а не их слияния.
Остается открытым вопрос о белках-партнерах на поверхности яйцеклетки и ЦК, с которыми взаимодействует GEX2.
У белка GEX2 есть N-клонцевая сигнальная последовательность (SS), filamin repeat domains (FLMN), и C-концевой трансмембранный домен
Опыт с плазмолизом ЯК (pe) и ЦК (pc). Возможно ли прикрепление спермия?

На протяжении роста пыльцевой трубки Arabidopsis белок HAP2/GCS1 локализован в эндомембранной системе спермиев.
Он выходит на поверхность в процессе активации спермиев, которую инициирует яйцеклетка.
Когда пыльцевая трубка лопается, высвобождая спермии, яйцеклетка секретирует в зону будущего слияния гамет белки EC1 (Egg Cell 1).

Активация гамет
При этом из эндомембранной системы на поверхность спермия выходят белки HAP2/GCS1.
Это происходит одновременно с распадом MGU и разделением спермиев и предшествует плазмогамии.
Таким образом, гаметы растений, как и других эукариот, приобретают компетентность и способность к слиянию, лишь пройдя этап предварительной активации

Яйцеклетка: скромная или активная?
В целом, слияние гамет у растений происходит почти так же, как у животных, однако при другом распределении ролей.
У животных яйцеклетка остается в состоянии покоя до тех пор, пока не сливается со сперматозоидом.
У Arabidopsis перед слиянием активируются обе гаметы, причем ведущую роль играет яйцеклетка

Предотвращение полиспермии
После высвобождения спермиев быстро прекращается аттракция новых ПТ.
Если слияния гамет почему-либо не произошло, первичный блок снимается, и сохранившаяся синергида привлекает в семяпочку дополнительные ПТ.
Таким образом, семяпочка получает еще один шанс на оплодотворение.
В случае успешного слияния гамет запускается дегенерация второй синергиды, и тем самым завершается процесс аттракции пыльцевых трубок в данную семяпочку.

Итак, слияние
Каким образом ядро спермия транспортируется к ядру женской гаметы? В яйцеклетках животных эту функцию осуществляют микротрубочки и центросомы, но у покрытосеменных растений нет центросом.
Перемещение ядер спермиев у них осуществляет актиновый цитоскелет женской гаметы.
Kawashima et al. eLife 2014;3:e04501. DOI: 10.7554/eLife.04501
Успешная кариогамия в ДТ
Нет кариогамии баз актина

Актин в ЦК
Актин – основной участник движения ядер спермиев как в ЯК, так и в ЦК
Его разрушение блокирует кариогамию

Детали
Ядро спермия, войдя в цитоплазму ЦК, окружалось волокнами F-актина с образованием звездообразной структуры.
Вся эта структура вместе с ядром спермия мигрировала по направлению к ядру ЦК.
Актиновая сеть в центральной клетке постоянно движется внутрь – от периферии клетки к ее ядру.
Этот процесс, по-видимому, играет важную роль в перемещении ядра спермия.

Кариогамия
1) наружные ядерные мембраны гамет соприкасаются и затем сливаются,
2) внутренние ядерные мембраны сливаются, и формируются мостики между ядрами,
3) мостики увеличиваются, и начинается деконденсация хроматина спермия.
www.plantphysiol.org/cgi/doi/10.1104/pp.114.236059