Глобальные регуляторные системы бактерий

Глобальные регуляторные системы бактерий
Совокупность генов и/или оперонов, подвергающихся глобальной регуляции при помощи одной и той же молекулы белка или РНК, называется регулон.
Совокупность регулонов, реагирующих на одни и те же условия окружающей среды, называется стимулон.
Сейчас мы немножко обо всем об этом поговорим.

Катаболитная регуляция
Это совокупность механизмов, позволяющих бактериальной клетке в каждый момент времени вовлекать в метаболизм тот источник углерода, от которого ей будет больше всего пользы (то есть энергии и катаболитов).
Хороший пример такой регуляции – так называемый диауксический рост клеток E.coli на среде с глюкозой и каким-либо другим источником углерода, например, галактозой. Хитрые бактерии сначала сожрут всю глюкозу, поскольку это самый энергетически выгодный для них субстрат, а уж когда глюкоза полностью закончится, переключатся на галактозу.
А если вы после этого дадите им опять глюкозы – они тут же плюнут на галактозу и опять примутся за свое любимое лакомство!

ЦиклоАМФ-зависимая катаболитная регуляция у E.coli
Каскад фосфорилирования и метаболизм сахаров
Глюкоза поступает в клетку с участием белка IIАGlc фосфотрансферазной системы сахаров. Если глюкозы много, то пирувата в клетке больше, чем фосфоенолпирувата. РЕР конвертируется в пируват, отдавая лишний фосфат на белок Hpr, но этих лишних фосфатов совсем мало. А с белка Hpr фосфаты переходят как раз на белок IIAGlc. В фосфорилированной форме он не способен активировать фермент аденилатциклазу, и уровень цАМФ в клетке низок. Помимо этого, IIAGlc без фосфата еще и подавляет транспорт низкоэнергетических сахаров (лактозы) в клетку.
Если же глюкозы в клетке мало, то РЕР становится больше пирувата. Он начинает активно конвертироваться в пируват, форфорилированного белка Hpr много, и все эти фосфаты передаются на IIAGlc. Фосфорилированный IIAGlc (1) активирует аденилатциклазу, и в клетке становится больше цАМФ, (2) перестает подавлять транспорт низкоэнергетических сахаров в клетку.
А цАМФ-то и нужен для глобального клеточного ответа на изменившийся источник углерода!

САР-регулон
САР – это cAMP-activated protein. Связавшись с цАМФ, этот белок становится активатором многих оперонов, связанных с метаболизмом сахаров (Lac, Gal, Ara и многие другие). Таким образом, все эти опероны подвергаются как специфической (как мы видели на прошлой лекции), так и глобальной регуляции. Механизмы САР-регуляции разные на разных оперонах.
Вот два примера работы САР на промоторах. В первом случае (Lac) он связывается с С-концевым доменом альфа-субъединицы РНК-полимеразы и стимулирует связывание фермента с -35 и -10.
Во втором случае (Gal) САР взаимодействует с N-концевым доменом той же субъединицы, что приводит к локальному расплетанию ДНК в районе начала транскрипции.
Но в любом случае у САР есть свой участок связывания ДНК, который всегда несколько выше промотора. И такое связывание возможно только для цАМФ-связанной формы белка!

Регуляция Lac-оперона оперонного и регулонного уровня
Единственный вариант, когда оперон активен – присутствие лактозы и отсутствие глюкозы. Во всех остальных случаях либо не будет активного САР (если есть глюкоза), либо будет специфический репрессор LacI (если нет лактозы).

Катаболитная регуляция у B.subtilis
Регуляция, основанная на цАМФ, вообще ни разу не универсальная. Например, у B.subtilis цАМФ вообще не синтезируется. Вместо него они используют белок СсрА. Но фосфорилирование и здесь важно, причем бацильный белок Hpr тут также играет роль.
СсрА действует на несколько десятков оперонов, связанных с метаболизмом сахаров, связываясь с так называемым cre-участком. Любопытно, что если cre находится выше промотора, то СсрА выступает как активатор транскрипции, а если cre перекрывается с промотором – то как репрессор!

СсрА-зависимая катаболитная регуляция у B.subtilis
Каскад фосфорилирования и метаболизм сахаров
При поступлении глюкозы в клетку активно запускается гликолиз , становится много промежуточного продукта, фруктозо-1,6-бисфосфата (FPB). Он активирует белок Hpr-киназу, которая фосфорилирует Hpr по остатку СЕРИНА. Hpr-S-P связывается с СсрА и активирует его, теперь он может связаться с ДНК и активировать/репрессировать транскрипцию.
Интересно, что тот же белок Hpr, фосфорилированный по остатку ГИСТИДИНА, активирует транспорт в клетку низкоэнергетических сахаров, как в случае E.coli. А фосфорилирование этого белка по СЕРИНУ ингибирует фосфорилирование по ГИСТИДИНУ. Соответственно, транспорт низкоэнергетических сахаров получается подавленным, если имеется большое количество глюкозы.

Регуляция ассимиляции азота
Азот входит в состав многих биологических молекул, поэтому его наличие является обязательным для жизни.
В большинстве случаев азот встраивается в биомолекулы в виде NH3. Поэтому все формы азота должны быть восстановлены клеткой до NH3 и потом уже использоваться в различных реакциях. Это называется ассимиляционное восстановление азота. А потом уже начинается собственно ассимиляция, то есть включение NH3 в биосинтез.
В зависимости от количества NH3, клетка может использовать разные пути его включения в биомолекулы. Соответственно, все это надо регулировать!

glnA-регулон и система передачи сигнала
Это как раз совокупность оперонов, регулирующихся в ответ на изменение концентрации NH3. Рассмотрим регуляцию оперона, содержащего glnA – ген глютаминсинтазы.
Эта система завязана на количестве азота в среде. Если NH3 мало, происходят реакции, выделенные синим: автофосфорилируется белок NtrB (ген входит в оперон). Этот белок – так называемая сенсорная киназа, он передает фосфат на белок NtrC (ген также входит в состав оперона) – так называемый регулятор ответа. Фосфорилированный NtrC способен активировать транскрипцию glnA-оперона и других оперонов данного регулона. Начинает синтезироваться глютаминсинтаза.
А если NH3 много, в дело вступает белок PII, который теряет УДФ-модификацию , потому что глютамин стимулирует белок GlnD, который ее и отщепляет. PII без модификации подавляет автофосфорилирующую активность NtrB, и дело кончается невозможностью активировать glnA-оперон и остальные опероны регулона. А оно и не надо – NH3 и так полно!

glnA-оперон устроен любопытным образом
В этом опероне три промотора, но только один (р2) подвержен NtrC-зависимой регуляции. Это потому, что остальные промоторы могут узнаваться обычной РНК-полимеразой с сигма70-субъединицей. А вот р2 подходит только для фермента с нестандартной сигма54-субъединицей.
Никаких -35 и -10 элементов в промоторах для сигмы54 (она же сигмаN) нет, вместо этого есть совсем другие элементы, -24 и -12.
Промоторы р1 и р3 нужны для того, чтобы в клетке даже в случае большого количества NH3 в среде имелись малые количества глютаминсинтазы, она же все равно нужна.

Механизм работы NtrC на сигма54-зависимых промоторах
Две молекулы NtrC должны сначала связаться с двумя участками UAS (upstream activated sequence). После этого NtrC может связаться с сигма54-содержащей РНК полимеразой (изгибая при этом ДНК). АТФазная активность NtrC приводит к началу расплетания ДНК и формирования «открытого комплекса», необходимого для нормальной инициации транскрипции.

Регуляция синтеза рибосомных белков
В геноме E.coli имеется несколько оперонов, состоящих из генов рибосомных белков. Все они регулируются схожим образом, формируя тем самым регулон рибосомных белков.
Если имеется свободная рРНК, то регуляторный белок (здесь – L1) будет с ней связываться и начинать сборку рибосом.
А вот если свободной рРНК мало, то избыток L1 начнет связываться с регуляторной областью первого гена оперона (здесь – rplK, кодирующий белок L11) и полностью подавлять транскрипцию. Таким образом, выходит, что количество молекул рРНК всегда равно количеству молекул каждого из рибосомных белков.

Stringent response (строгий ответ)
Этот тип регуляции приводит к тому, что синтез рРНК и тРНК подавляется в условиях голодания по одной или более аминокислоте.
Основной компонент stringent response – гуанозинтетрафосфат (ppGpp). Он синтезируется в ответ на ситуацию, когда в клетке нет аминокислоты (на рисунке – лизина). Когда рибосома доходит до лизинового кодона ААА, она останавливается, потому что нет аминоацилированной тРНК-Лиз с антикодоном UUU, которую мог бы доставить в А-участок рибосомы фактор EF-Tu. Однако есть деацилированная лизиновая тРНК, которая при достаточно долгой паузе (а она вообще будет бесконечной, раз лизина нет) может случайно войти в А-участок рибосомы даже без помощи EF-Tu.
Деацилированная тРНК в А-участке – сигнал для белка RelA, который мгновенно начинает синтез ppGpp, перенося фосфаты на 3’-конец ГТФ с молекулы АТФ.
Молекулярный механизм работы ppGpp до конца не известен, но он подавляет транскрипцию генов рРНК и тРНК. А раз нет рРНК, то нет и рибосомных белков! Это серьезная экономия энергии для клетки.

Heat shock response (ответ на тепловой шок)
При повышении температуры бактериальная клетка начинает синтезировать целый ряд так называемых белков теплового шока – в основном это шапероны и протеазы, щепящие неправильно сложившиеся белки. Но начинается все опять с необычной сигмы!
В норме синтез такой сигмыН выключен из-за шпильки, включающей в себя SD этой мРНК. Но она расплетается само по себе при повышении температуры, это термосенсор! И уж тогда сигмаН начинает синтезироваться в больших количествах, что, в свою очередь, разрешает синтез белков теплового шока со специальных сигмаН-промоторов.

Heat shock response (ответ на тепловой шок)
Белок DnaK в нормальных условиях связывается с новосинтезированными белками и помогает им правильно складываться. Связывается он и с сигмойН (если температура уже понизилась, а этой сигмы еще полно), и это приводит к деградации сигмыН. А при повышенной температуре DnaK связывается только с неправильно сложенными белками и помогает им свернуться правильно, а заодно и оставляет в покое сигмуН, которая спокойно запускает экспрессию всего Hsr-регулона.

Регуляция метаболизма железа
Железо – важная штука для любого живого организма, и бактерии – не исключение. Однако с железом надо быть аккуратным – его избыток приводит к формированию супероксид-ионов из перекиси водорода, а это самый жуткий мутаген для клетки.
Гены, вовлеченные в метаболизм железа, организованы в Fur-регулон.
Когда железа в клетке много, ионы Fe2+ связываются с белком Fur и превращают его в репрессор, действующий по классическому механизму на опероны генов ассимсиляции железа (мембранные транспортеры и т.д.).
Когда железа мало, Fur находится в состоянии апорепрессора, и транскрипция ассимиляторов железа идет вполне активно.

Регуляция метаболизма железа
В частности, при малом количестве железа активируется транскрипция гена ryhB. Этот ген кодирует короткую РНК, которая при помощи РНК-шаперона Hfq связывается с 5’-участками мРНК белков, которые, наоборот, начинают активно синтезироваться при высоком содержании железа (по другим механизмам; здесь – мРНК Sod1, кодирующая супероксиддисмутазу, фермент конвертации перекиси водорода в супероксид-радикалы). Получается дцРНК, которая есть субстрат для деградации клеточными системам и РНК-интерференции.
Таким образом, то небольшое количество железа, которое имеется в клетке, становится доступно для белков, для которых оно и должно быть доступно в таких условиях, а белки, оперирующие с железом в больших количествах, исчезают – деградируют их мРНК.

Железозависимая регуляция у дифтерийных коринебактерий
В клетках эукариот свободного железа практически не бывает – все оно связано с гемом или другими белками. Для любого внутриклеточного паразита снижение концентрации железа – сигнал того, что он попал в хозяйскую клетку. А значит, пора проявлять патогенность!
Пока железа много, оно связано с репрессором DtxR, подавляющим экспрессию гена дифтерийного токсина.
Когда железа становится мало, DtxR переходит в состояние апорепрессора, транскрипция начинается, токсин синтезируется, наступает адская дифтерия!
Любопытно, что ген токсина вообще-то принадлежит лизогенному профагу бета, а ген dtxR – из генома самой бактерии, которая без профага совершенно безобидна!

Регуляция патогенности холерного вибриона
Холерный вибрион так устроен, что его патогенность проявляется в тонкой кишке человека, вызывая сильнейшую диарею вплоть до летального исхода. В тонкой кишке (1) высокая осмолярность, (2) высокие количества некоторых аминокислот, которые в других местах, наоборот, редки. Совокупность этих факторов вызывает активацию патогенности.
Регуляцией занимаются белки ToxS и ToxR. Они не только активируют синтез факторов вирулентности (OmpT, OmpU) и собственно токсинов (CtxA, CtxB), но и помогают им встроиться во внешнюю мембрану, чтобы можно было успешно заражать несчастных хозяев.