Когда известно название гена

Со всеми обратным праймерами проблемы, поэтому нужно подобрать другие им на замену.

Ничего страшного. Просто расширяем зону поиска сайтов посадки праймеров.

Остальные два праймера тоже хорошо подходят, но тут нужно выбирать в зависимости от цели, какой длины ПЦР продукт нужен.

Когда есть «неизвестная» последовательность ДНК
На примере гена NBS-LRR гена детекции патогенов у люцерны (давайте сделаем вид, что сиквенс действительно случайный)

Далее возвращаемся к разделу Primer3 и делаем как делали ранее.
То есть все то же самое, только если бы у Вас не было названия гена, а был какой-то его сиквенс.

Но. Если есть название гена, который пересекается с нашим сиквенсом, то можно сделать точно также, как мы делали с самого начала.