Обработка протеомных данных (массспектрометрия)

Подходы к анализу в протеомной масс-спектрометрии
I. “Восходящий” анализ – Bottom-up
гидролиз белка/белков, масс-спектрометрия малых пептидных фрагментов
II. “Нисходящий” анализ – Top-down
анализ без гидролиза (интактные протеины)
III. Middle-down
гидролизат состоит из более крупных пептидов

Два главных подхода к протеомному анализу

Top-down: изучение интактных белков
1). Позволяет изучать индивидуальные протеины.
2). Является низкопроизводительным подходом.
Исключение: изучение белкового спектра для идентификации бактериальных культур. Данная методика предусматривает высокопроизводительное сравнительное исследование целых протеомов (однако, имеет ограниченную информативность о природе белков).

Bottom-up
Данный подход преобладает в протеомных исследованиях.
Существует в двух вариантах:
1. Выделение одного/нескольких белков (PAGE), их гидролиз –> масс-спектрометрия.
2. Гидролиз сложной смеси белков –> хроматомасс-спектрометрия.
Второй вариант известен также как протеомное исследование по методу дробовика – shotgun proteomics.

Типы протеомного исследования
1. Определение наличия в образце белков с известной последовательностью (“ресеквенирование” белков).
2. Определение последовательности белков de novo.

Определение белков de novo
Применяется на основе bottom-up подхода (анализ пептидных спектров). В данном случае требуется (особенно для сложных смесей белков) использование тандемного хроматомасс-спектрометра (LC-MS/MS). MS/MS обеспечивает большую разрешающую способность за счёт образования большего числа ионов.

Основа анализа масс-спектров – определение типов образующихся ионов
В подавляющем большинстве методов МС в результате ионизации образуются положительно заряженные ионы (протонирование, [M+H]+). При этом из одной изначальной молекулы (или иона в случае второго этапа MS/MS) может образовываться несколько типов ионов:
1). Протонированная исходная молекула – простое присоединение иона H+.
2). Множество ионизированных кусочков исходной молекулы – в результате миграции иона H+ по молекуле и его “оседания” около какой-либо связи происходит разрыв по этой связи.

Главные типы ионов, образующихся в протеомной МС
Существует три вида связей в пептидах, по которым происходит ионная фрагментация:
а). Алкил-карбонильная: HC(R) – CO (ионы типа a или x)
б). Пептидная: C(O) – NH (ионы типа b или y)
в). Амино-алкильная: HN – CHR (ионы типа c или z)
6 типов ионов возникают из-за того, что заряженным может быть фрагмент как слева от связи (ближе к N-концу; типы a, b, c), так и справа (ближе к C-концу; типы x, y, z). В качестве нижнего индекса к типу иона приписывают количество аминокислотных остатков, его образующих (напр., y2, b1).
Наиболее распространёнными являются ионы типов b и y (комплементарные ионы). Часто встречаются a-ионы, образующиеся из b-ионов в результате потери карбонильной группы (CO).

Дополнительные пептидные ионы
При более жёсткой ионизации наряду с главными ионами происходит образование саттелитных ионов (d-, v-, и w-типы).
В этих ионах по сравнению с главными ионами происходит дополнительное присоединение H+ к аминокислотному радикалу.

Главные и саттелитные пептидные ионы

Связь между массой главного иона и массами аминокислотных остатков иона
Масса образующихся главных ионов определяется суммой масс аминокислот, входящих в их состав с учётом особенностей образования (с N- или C-конца; первичный или вторичный ион):
m(b)=∑m(aa) + 1 ; 1 – масса протона
m(y)=∑m(aa) + 19 ; 19 – масса протона+молекула воды
m(a)=m(b) - 28 ; 28 – масса карбонила (CO)

Массы аминокислотных остатков, главных и соответствующих главных (a1-ионы; immonium ion) и сателлитных ионов (related ions)

Массы b2-ионов

“Правила” ионизации пептидов
1). Подавляющее большинство ионов приходится на b-, y- и a-ионы. а-Ионы образуются из b-ионов в результате отщепления CO.
2). Аминокислоты, содержащие гидроксильную группу в радикале (Ser, Thr, Asp, Glu), при ионизации теряют её в виде воды (-18).
3). Аминокислоты, содержащие аминогруппу в радикале (Lys, Arg, Asn, Gln), при ионизации теряют её в виде аммиака (-17).
4). Наличие на C-конце оснóвной аминокислоты (Arg, His, Lys) приводит к образованию вместо иона bn иона (bn-1+18).
5). Комплементарные ионы (bn и yN-n), образующиеся из одного пептида, в сумме дают одно и то же значение массы пептида из N аминокислот (точнее, массу пептида + 2 из-за двух ионов водорода).

Количественный протеомный анализ
Позволяет оценивать относительные количества одинаковых белков их разных источников в результате анализа смешанного образца.
Выделяют несколько методов:
I. С введением метки – исследуемые белки метят молекулами, содержащими разное количество стабильных изотопов 13C и 15N.
1). Метаболическая метка
2). Химическая метка
II. Без введения метки – анализ хроматограмм или пиков специфических пептидных ионов, отвечающих отдельным протеинам.

Виды количественного протеомного МС-анализа

Схема метаболического мечения белков – культивирование клеток на средах с разным содержанием “лёгких” и “тяжёлых” аминокислот – метод SILAC

Форматы представления МС-данных
1. “Родные” форматы приборов
TDF (Bruker), t2d (ABI), lcd (Shimadzu), tdc (Physical Electronics) и мн. др.
2. Универсальные форматы
mzXML, mzXL

Примеры представления данных из mzXML файлов в разных программах (a,b – InsilicosViewer; c – mzXML Spectrum Viewer; d - Pep3D)
a,c – масс-спектры и хроматограммы; b – масс-спектры четырёх экспериментов; d – оценка результатов исследования после поиска в пептидной базе данных

Анализ результатов МС-эксперимента
1. Поиск по базам данных масс-спектров пептидных фрагментов записей, отвечающих (с учётом посттрансляционных модификаций) с полученными данными (напр., SEQUEST).
2. Расчёт вероятности правильного определения пептидов (напр., PeptideProphet).
3. Поиск по базам данных масс-спектров триптических гидролизатов белков соответствий с выявленными пептидами и оценка вероятности правильного определения белков (напр., ProteinProphet).
4. [Для количественных исследований] Определение количественного отношения белков из разных источников (напр., XPRESS).
5. Интерпретация качественных и количественных данных с помощью метаболических сетей (Cytoscape).

Пример результатов анализа масс-спектра с помощью инструмента MS-Fit онлайн-ресурса ProteinProspector

FASTA – универсальный формат представления первичной структуры белков и нуклеиновых кислот
>BBB04705.1 M1 protein [Influenza A virus (A/WSN/1933(H1N1))]
MSLLTEVETYVLSIVPSGPLKAEIAQRLEDVFAGKNTDLEVLMEWLKTRPILSPLTKGILGFVFTLTVPSERGLQRRRFVQNALNGNGDPNNMDKAVKLYRKLKREITFHGAKEIALSYSAGALASCMGLIYNRMGAVTTEVAFGLVCATCEQIADSQHRSHRQMVTTTNPLIRHENRMVLASTTAKAMEQMAGSSEQAAEAMDIASQARQMVQAMRTVGTHPSSSAGLKDDLLENLQAYQKRMGVQMQRFK

Обозначение аминокислот в формате FASTA

Трёхмерная структура гемагглютинина H1, полученная с помощью средств базы данных PDB (разным цветом обозначены разные участки вторичной структуры)