Основные направления применения ЭПР-спектроскопии в биологических исследованиях

Основные направления применения ЭПР-спектроскопии в биологических исследованиях
Исследование нативных биологических объектов (свободные радикалы и ионы металлов переменной валентности)
Исследование свободных радикалов с использованием спиновых ловушек
Применение спиновых меток и зондов

Сигналы ЭПР печени и крови
1- гемовое железо каталазы
2- гемовое железо метгемоглобина
3- негемовое железо трансферина
4- медь церулоплазмина
5- свободный радикал глобина
Т = 77 К
Т = 10 К

Сигнал ЭПР радикала аскорбата
Сигнал ЭПР радикала аскорбата можно наблюдать непосредственно в крови или плазме.
Добавление пероксидазы приводит к увеличению сигнала ЭПР и последующему его исчезновению. Длительность кинетики пропорциональна концентрации аскорбата в крови.
аскорбат
аскорбат + пероксидаза

Спектры ЭПР радикалов α-токоферола

Спектр ЭПР семихинонного радикала убихинона Q10

Спектр ЭПР облученного УФ светом цистеина
hν

Схема расположения электронных переносчиков в тилакоидной мембране хлоропласта и типичные спектры ЭПР переносчиков
Тихонов А.Н. Соросовский образовательный журнал, 11, 1997

Кинетика изменения сигнала ЭПР 1 от окисленных реакционных центров фотосистемы 1 в хлоропластах, вызванных действием света с различной длиной волны

Спектры ЭПР гемоглобина в присутствии NO

Спектр ЭПР эмали зубов и зависимость интенсивности радиационно-индуцированного сигнала 2 от дозы дополнительного ионизирующего излучения

Основные направления применения ЭПР-спектроскопии в биологических исследованиях
Исследование нативных биологических объектов (свободные радикалы и ионы металлов переменной валентности)
Исследование свободных радикалов с использованием спиновых ловушек
Применение спиновых меток и зондов

Основные виды спиновых ловушек
нитрозосоединения
нитроны
Нитронил-нитроксилы
PBN
DMPO
нитрозобензол
трет-нитрозобутан
DEPMPO
NNR

Взаимодействие PNB и DNPO со свободными радикалами
PNB
DNPO

Спектры ЭПР PNB
Pre- (A) and postexercise (B) electron spin resonance (ESR) spectra of α-phenyl-tert-butylnitrone (PBN) adduct in human plasma after maximal aerobic exercise.
Ashton et al. Electron spin resonance spectroscopy, exercise, and oxidative stress: an ascorbic acid intervention study. Journal of Applied Physiology Published 1 December 1999 Vol. 87 no. 6, 2032-2036

Кинетические и спектральные характеристики спиновых аддуктов

Основные направления применения ЭПР-спектроскопии в биологических исследованиях
Исследование нативных биологических объектов (свободные радикалы и ионы металлов переменной валентности)
Исследование свободных радикалов с использованием спиновых ловушек
Применение спиновых меток и зондов

Формула и спектр ЭПР нитроксильного радикала
2,2,6,6-тетраметил-пиперидин-1-оксил (ТЕМПО)

Cпектр ЭПР ТЕМПО при разных τс
Время корреляции,
τc
Если нитроксильный радикал находится в водном растворе, то его вращение является изотропным и достаточно быстрым. Это движение можно охарактеризовать временем корреляции (τс):
При уменьшении скорости вращения проявляются анизотропные взаимодействия, которые приводят к уширению линий и соответственно изменению амплитуд компонент спектра, а затем и к сдвигу крайних компонент.
где ΔH +1 - ширина низкопольной компаненты
I+1 - амплитуда низкопольной компаненты
I-1 - амплитуда высокопольной компаненты

Влияние температуры на форму спектра ЭПР спинового зонда

Молекулярные оси парамагнитного фрагмента нитроксильных радикалов и спектры ЭПР жестко ориентированного нитроксила
X
Y
Z
раствор

Спектр ЭПР 16-доксил стеариновой кислоты в мембране и схема определения параметра τ

Спектр ЭПР 5-доксил стеариновой кислоты в мембране и схема определения параметра S

Параметр упорядоченности S
S = 1
0 < S < 1
Параметр упорядоченности S равен 1, если вращение зонда происходит только вокруг нормали к плоскости мембраны.
В «замороженных» мембранах, где липиды находятся в кристаллическом состоянии параметр упорядоченности S близок к 1.
Параметр упорядоченности S меньше 1, если вращение зонда происходит по конусу вокруг нормали к плоскости мембраны.
В «жидких» мембранах отклонение конуса вращения возрастает и S снижается, что вызывает изменения в спектре ЭПР.

Изменения сигнала ЭПР при уменьшении S и возрастании угла отклонения конуса вращения γ

Значения параметров S и τ у пациентов с сердечно-сосудистыми заболеваниями
Estimation of the erythrocytes plasma membrane fluidity in the regions of 0.6-0.8 nm (A) and 2.2-2.4 nm (B) from the membrane surfaces. The increase in the S- and τ- parameters means the decrease in the membrane fluidity. Heart failure decreases fluidity in the surface regions of the membrane and ischemia and hypertension – in the deeper membrane regions
Vertical bars indicate S.D., * p<0.05; **p<0.01
O.V. Rodnenkov, et.al. International Journal Pathophysiology,v.11./4,2005

Высокогорная гипоксия
Mountain hypoxia (as well as heart failure) decreases plasma membrane fluidity of erythrocytes near the membrane surface (A) and does not affect deeper regions (B).Vertical bars – S.D., * p< 0.05
O.V. Rodnenkov, et.al. International Journal Pathophysiology,v.11./4,2005

Спектры ЭПР спиновых зондов в различных средах
буфер
мембраны эритроцитов
мембраны липосом

Альбумин

Сигналы ЭПР спинового зонда 16-DS в коипонентах плазмы крови

Распределение спинового зонда между 1 и 2 сайтом связывания жирных кислот человеческого сывороточного альбумина
1 сайт связывания
2 сайт связывания
Группа I
Группа II
Кровь отбиралась до введения препарата Оксаком
Кровь отбиралась через 15-20 мин после введения препарата Оксаком