Самонесовместимость. Лекция 8

ТИПЫ НЕСОВМЕСТИМОСТИ
Три системы охарактеризовано на молекулярном уровне:
SSI – спорофитная самонесовместимость (крестоцветные)
S-гликопротеиновый (маковые)
SРНКазный тип, характерный для паслёновых, розоцветных и подорожниковых
Гаметофитная самонесовместимость

ГСН/ССН
Спорофитная СН: фенотип пыльцы определяется геномом родителя (спорофита)
Гаметофитная СН: фенотип пыльцы определяется гаплоидным геномом (гаметофитным)
Гаметофитная СН шире распространена (60-90 семейств)

Гаметофитная самонесовместимость
Рост пыльцы подавляется только тогда, когда она вошла в проводниковый тракт столбика.
А на рыльце казалось, что всё у нас получится…

Гаметофитная SI у мака
Две S-детерминанты S-локуса мака уже достаточно хорошо изучены:
PrpS кодирует трансмембранный белок ∼20 kDa, специфичный для пыльцы
PrsS ∼14 kDa белок, выделяемый на поверхность пестика

Вход кальция
При СН ответе активируются катионные каналы
Это наиболее ранний из зарегистрированных ответов СН трубок
[Ca2+ ]цит, повышается почти мгновенно, однако максимум не в кончике, а в области ядра!
Пик кальция совпадает по времени с остановкой роста

Вход калия
На 15 лет позже был обнаружен также
Вход калия, причем более массивный
Происходил одновремено со входом кальция, но через другие каналы
Оба тока в этом исследовании фиксировали методом пэтч-кламп

Нарушение микрофиламентов
Уже через 10 минут нормальный актиновые филаменты разрушаются, а через 3 часа образуются «шарики» актина, которые растут со временем
Актин-связывающий белок PrABP80 (Papaver rhoeas actin-binding protein 80), обладающий свойствами гельзолина – потенциальный посредник между кальцием и разрушением филаментов (возможно, совместно с профилином)
Ещё два белка были локализованы в «шариках»: ADF (actin-depolymerizing factor) и CAP (cyclase-associated protein)

Нарушение микротрубочек
Микротрубочки в трубке полностью разрушаются уже через 1 минуту!
В генеративной клетке МТ остаются
тубулин
актин

АФК – ангелы смерти
Через 5 минут после индукции СН происходит быстрое транзиентное повышение цитозольных АФК
После этого происходит повышение NO
Предварительная обработка ингибитором NADPH-оксидазы DPI и тушителем NO cPTIOсущественно снижало активность каспазоподобного белка DEVDase. По отдельности тушители не могли справиться с этим.
По-видимому, ROS и NO действуют в тандеме для запуска клеточной гибели через DEVDase.

ROS
NO
Ca2+

Резюме по маку
PrsS and PrpS узнают друг друга →
Вход Ca2+ и сопутствующее повышение [Ca2+]цит
Ca2+ -зависимое фосфорилирование sPPases (soluble inorganic pyrophosphatases)
Повышение АФК и NO

Модификация цитоскелета: деполимеризация актиновых филаментов и образование «шариков»
Активация MAPK (mitogen-activated protein kinase) p56
Закисление цитозоля
Кислый рН – оптимальный для активности каспаз
Запуск PCD: утечка из митохондрий цитохрома с, активность каспаз и фрагментация ДНК

S-РНКазная СН
Широко распространена
Ген женской детерминанты S-RNase кодирует РНКазу
Многочисленные генетические детерминанты с мужской стороны: S-locus F-box (SLF)
32 S-гаплотипов было обнаружено у петунии.
SLF входит в класс E3 убиквитин лигаз, включенный в деградацию белков в 26S протеасоме

Партнер или паразит?!
Ученые заметили, что коэволюция женских и мужских детерминант идёт разными путями (у пасленовых).
Если разнообразие мужских детерминант ведёт к ↑ числа партнеров и ↑шансов на потомство (они могут распознать и обезвредить большее число РНКаз), то разнообразие женских (больше разных (РНКаз) – к противоположному эффекту
Этот паттерн больше поход на модель «паразит – защита» или «болезнь – иммунитет», чем на другие модели самонесовместимости.

Каков же паттерн?
Sx-РНКаза является мишенью для SLFn если Sx-аллель SLFn изменён или удалён.
Этот упрощённый подход очень полезен для поиска S-РНКаз-мишеней для каждого типа SLF.
Kubo et al., 2015. Nature plants 1

Так думали раньше…
Считали, что транспорт S-РНКаз в трубку специфичный, и «несвои» просто не заходят
Но оказалось, что заходят любые, и «решение» принимается внутри

S-РНКаза
S-РНКаза синтезируется в проводниковом тракте , пока пыльцевые трубки растут через столбик.
Трубки поглощают все имеющиеся типы РНКаз: «свою», то есть ту, которая является продуктом того S-гаплотипа, который несёт пыльца, и «чужую».
«своя» РНКаза не разлагается и ингибирует рост пыльцевой трубки (обычно в верхней трети столбика).
Диплоидный пестик несёт 2 гаплотипа, каждый из которых продуцирует аллельный вариант S-РНКазы.
Гены S-РНКаз высоко полиморфны, имеют 2 участка гипервариабельности

S-РНКаза (продолжение)
Этот фермент деградирует рРНК в самонесовместимой пыльце
При потере РНКазной активности СН не работает

Более ранние модели
Предполагали, что узнается своя РНКаза и не деградирует, а начинает своё чёрное дело
В этом случае чужие РНКазы «не узнаются» и деградируют
Однако, в последние 5 лет на смену этой модели пришла другая, более «абсурдная»

Чужие SРНКазы «не узнаются» и отправляются на деградацию в протеасому
Своя SРНКаза узнаётся рецептором SLF (S-locus F-box) в цитоплазме трубки и начинает работать
Старая модель
Journal of Experimental Botany, Vol. 61, No. 7, pp. 2027–2037, 2010

Новая модель: коллективное узнавание
Многочисленные SLF белки, которые производит пыльца данного S-гаплотипа, вместе узнают и дезактивируют все non-self S-РНКазы
Каждая отдельная детерминанта SLF может взаимодействовать с ограниченным набором non-self S-РНКаз
Ни одна из них не может взаимодействовать со «своей»

Резюме по петунии: помиловать?
Представлены два возможных механизма узнавания и деградации «чужих» РНКаз
В любом случае первый процесс: вход (эндоцитозом или через мембрану)
Параллельный процесс – дегликозилирование (необязательно)
Далее узнавание и деградация

Резюме по петунии: казнить?
Своя РНКаза также входит в трубку двумя возможными путями и дегликозилируется
тоже немножко деградирует, но в отсутствии узнавания белка остается еще достаточно, чтобы всё порушить

Спорофитная СН (крестоцветные)
Меняемся ролями: мужской пепитид – лиганд, женский – рецептор
У капусты S-локус очень сложный, включает 17 генов. Естественно, высокий полиморфизм.
Женская детерминанта – SRK (S-receptor kinase) экспрессируется в папиллах рыльца
S-домен (вариабельный) торчит в межклеточное пространство

Мужская детерминанта – SCR/SPP (S-locus cystein-rich protein, S-locus pollen protein)
Полиморфизм мужской детерминанты выше
Она экспрессируется в тапетуме и встраивается в трифину (pollen coat)
Также в S-локусе присутствует SLG (S-locus glycoprotein) – секретируемый гликопротеин рыльца.
Он помогает, но не является обязательным.
Возможно, стабилизирует/активирует накопление киназы

Cубклеточная локализация SRK
SRK обнаружены в плазмалемме и эндосомах у капусты
Присутствует на ПМ
В цитоплазме локализуется как в МВТ, так и в ЭПР, Гольджи и везикулах около АГ

Колокализация с эндосомой
Использовали 2 маркёра эндосом, оба показали, что SRK находится там
Для сравнения: транс-Гольджи

Интернализация SRK
Как может быть, что одна сторона клетки отвергает «неугодную» пыльцу, а на другой может примоститься «фаворитка», если ответ осуществляется целой клеткой?
Исследуя субклеточную локализацию до и в момент ответа, обнаружили, что
В момент встречи с несовместимой пыльцой происходит быстрая интернализация SRK3
Используя антитела к SRK3 в качестве лиганда, обнаружили, что после встречи с лигандом происходит интернализация комплекса.

SRK и эндосомы
Клетка папиллы рыльца в ожидании пыльцы: SRK концентрируется в мембране, а в эндосоме находится в неактивном состоянии, ингибированная THL1
При встрече с СН пыльцой происходит фосфорилирование SRK – такие комплексы интернелизуются и деградируют
Это локальная реакция! К той же клетке может с другой стороны прижаться совместимая пылинка

Резюме по капусте