Транскрипция. Исследования транскрипции

Исследования транскрипции
В 1961 г. Франсуа Жакоб, Жак Моно предположили существование матричной РНК посредника.
Триплетность кода: Эксперименты Френсиса Крика с мутациями сдвига рамки считывания у фага Т4. Вставка или делеция одного или двух нуклеотидов приводят к мутации, но не при вставке или делеции трех.

Метод связывания триплетов
В 1964 г. Ниренберг и Ледер разработали данный метод для установления точной последовательности кодонов.
Триплеты-кодоны иРНК комплементарны последовательностям тРНК , которые называются антикодонами.
Аминокислота метилась изотопом и прослеживалось какой из триплетов иРНК связывается с кодоном. Комплекс меченной тРНК и иРНК оставался на фильтре.

Использование повторяющихся кополимеров
Гобинд Корана синтезировал протяженные молекулы РНК с заданной последовательностью, многократно повторяющейся.
Из 2, 3-х, и тетрануклеотидные повторы:
UGUGUGUG
UUGUUGUUGUUG
UACGUACGUACGUACG
Определяли теоретически ожидаемые пропорции аминокислот при добавлении таких иРНК в бесклеточную систему синтеза белков

Wobble hypothesis
В 1966 г. Ф.Крик сформулировал гипотезу качания (wobble hypothesis).
Предположил, что для комплементации с тРНК важны только первых два рибонуклеотида, т.к. водородная связь в третьей позиции пары кодон-антикодон более свободная, чем между первыми двумя.
Это позволяет антикодону одного типа тРНК спариваться с несколькими триплетами иРНК.
Т.о. для кодирования аминокислот 61-м триплетом требуется около 30 различных тРНК.
Экономичность, без ущерба точности трансляции.

Базис транскрипции

РНК-полимераза
РНК-полимераза - фермент, участвующий в синтезе РНК на ДНК-матрице.
Использует в качестве субстрата рибонуклеозидтрифосфаты (NTP), не нуждается в праймерах.
Катализирует полимеризацию нуклеотидмонофосфатов (NMP) в полинуклеотидную цепь (NMP)n.
(NMP)n+NTP = (NMP)n+1 + Ppi
Праймер — короткий фрагмент нуклеиновой кислоты (олигонуклеотид), комплементарный ДНК- или РНК-мишени; служит затравкой для синтеза комплементарной цепи с помощью ДНК-полимеразы (при репликации ДНК).

Виды РНК-полимераз

Базис транскрипции
Единица транскрипции – транскриптон, участок ДНК, ограниченный промотором (зоной начала транскрипции) и терминатором (зоной остановки транскрипции).
Участки молекулы ДНК, которые транскрибируются, называют структурными генами, а участки ДНК, которые не транскрибируются, но регулируют процесс синтеза РНК, — регуляторными генами (или регуля- торными элементами).

Последовательность транскрипции

Основные принципы транскрипции

Процессинг
1.Кэпирование 5'-конца – присоединении к этому концу иРНК так называемой шапочки (кэп-структуры – 7-метилгуанозина);
2.Полиаденилирование 3'-конца – образование поли(A)-шлейфа, длиной до 200 нуклеотидов.
3. Сплайсинг – вырезание протяженных внутренних участков иРНК, так называемых интронов, и ковалентное воссоединение оставшихся фрагментов (экзонов) через обычную фосфодиэфирную связь.
Экзоны-последовательности, которые транскрибируются в зрелые РНК и с которых транслируются полипептиды.

Кэпирование
Функции кэпа: защита 5'-конца транскрипта от экзонуклеаз; участие в сплайсинге; экспорт мРНК из ядра; участие в инициации трансляции.

Сплайсинг
В зависимости от специфичности механихма сплайсинга, интроны подразделяются на группы:
Интроны, которые сами обладают ферментативной активностью для вырезания
Интроны, которые сами не способны вырезаться.
Вырезаются с помощью сплайсосом.
Сплайсосома-комплекс из специфичных белков, акцептируемых концевыми последовательностями длинных интронов.
Существует также альтернативный сплайсинг.

Сплайсосома

Схема сплайсинга с сплайсосомой

Альтернативный сплайсинг