Izolace, separace a detekce proteinů část ii

SDS-PAGE
(= sodium dodecylsulphate - polyacrylamide gel electrophoresis)
- metoda pro separaci proteinů dle velikosti (molekulové hmotnosti)
Molekulová hmotnost (velikost) proteinů udávána v daltonech (Da)
či kilodaltonech (kDa)
1 kDa = 1000 Da
= 1 Da se přibližně rovná hmotnosti atomu vodíku (1,66 x 10 -24 g)

Pracovní postup
smíchání proteinových roztoků se vzorkovým pufrem
povaření vzorků při 95°C
nanesení vzorků na gel
separace proteinů - proteinová elektroforéza
příprava polyakrylamidových gelů pro další studijní kruh
barvení proteinů v gelu pomocí Coomassie Brilliant Blue
odmytí nenavázeného barviva
analýza gelů

proteiny je nutné před separací denaturovat
obvykle působením SDS, merkaptoethanolu a zahřátí (cca 95°C)
denaturované proteiny mají vláknitý tvar a stejný záporný náboj na jednotku délky proteinu - zachována je tak pouze primární struktura proteinů
rychlost migrace v gelu závisí pouze na jejich molekulové hmotnosti
Příprava vzorku pro SDS-PAGE

Vzorkový pufr pro SDS-PAGE
SDS (dodecyl sulfát sodný) - detergent denaturující proteiny a poskytující jim negativní náboj
Merkaptoethanol - redukuje disulfidické můstky
Glycerol - zajišťuje klesnutí vzorku ke dnu jamky v gelu po nanesení
Bromfenolová modř - barvivo umožňující sledovat průběh elektroforézy (pohyb čela v gelu)

Negativně nabité proteiny se pohybují ke kladné elektrodě (anoda)
Menší proteiny se pohybují rychleji
Jak funguje SDS-PAGE?
+
_

Polyakrylamidové gely
gel: porézní 3D síť
⇨ taková velikost pórů v gelu, aby se separované molekuly s různou velikostí pohybovaly rozdílnou rychlostí
proteiny - obvykle polyakrylamidový gel (menší velikost pórů)
vytvořen polymerizací akrylamidu - potřeba volných radikálů vzniklých při rozkladu persíranu amonného (ammonium persulfate = APS) a katalyzátoru TEMED (Tetramethylethylenediamine)
Obvykle se připravují dva gely, zaostřovací a separační

Separované proteiny jsou poté nespecificky barveny pomocí roztoku Coomassie Briliant blue