Основы постановки научного эксперимента. Масс-спектрометрия. (Лекция 9)

Содержание

Слайд 2

Метод основан на переводе частиц исследуемого вещества в состояние ионизированного газа с

Метод основан на переводе частиц исследуемого вещества в состояние ионизированного газа с
последующим их разделением и детектированием.
Стадии эксперимента:
1. Предподготовка пробы
2. Подготовка, ввод и ионизация пробы
3. Ускорение ионов
4. Разделение ионов
5. Детектирование ионов
6. Обработка сигналов

Основы метода

Слайд 3

Основные понятия

Вещество - форма материи, состоящая из кварков и лептонов (ядер и

Основные понятия Вещество - форма материи, состоящая из кварков и лептонов (ядер
электронов)
Ион — заряженная частица вещества
Масс-спектрометрия — метод исследования вещества при помощи разделения ионов по отношениям массы к заряду (т/z)
Масс-спектр — зависимость интенсивности ионного сигнала от т/z (график или таблица)
Масс-спектрометр — прибор для получения масс-спектра

Слайд 4

Возможности масс-спектрометрии

С помощью масс-спектрометрии можно анализировать высокомолекулярные соединения с массой до нескольких

Возможности масс-спектрометрии С помощью масс-спектрометрии можно анализировать высокомолекулярные соединения с массой до
млн. Да (белки, полипептиды, синтетические полимеры и пр.).
Можно детектировать следовые количества веществ до 10-14 грамм.
В 2004 было сообщено о беспрецедентном пределе обнаружения в 480 молекул (800 иоктомоль) для брадикинина (пептид)*.

*https://pubs.acs.org/doi/10.1021/ac049657j

Слайд 5

Возможности масс-спектрометрии

Для низкомолекулярных веществ молекулярная масса (MW) может быть определена с точностью

Возможности масс-спектрометрии Для низкомолекулярных веществ молекулярная масса (MW) может быть определена с
1 м.д. или 0.0001%, что достаточно, чтобы подтвердить брутто-формулу исходя только из массы
Для больших биомолекул MW может быть определена с точностью 0.002% (то есть 1 Да для белка массой 40 кДа)
1 Дальтон = 1 атомная единица массы (1 amu)

Слайд 6

Информация, получаемая из масс-спектрометрии

1. Прямое измерение массового числа молекулы вещества, т.е. её

Информация, получаемая из масс-спектрометрии 1. Прямое измерение массового числа молекулы вещества, т.е.
молекулярной массы, в случае, если вещество в условиях масс-спектрометрического эксперимента дает молекулярный ион – заряженную частицу, имеющую ту же массу.
2. При использовании масс-спектрометрии высокого разрешения возможно получение очень точного значения молекулярной массы, что позволяет по известным табличным данным получить брутто-формулу вещества.
3. Получение масс-спектра вещества, что позволяет провести его идентификацию по библиотекам масс-спектральных данных или по характеру фрагментации предположить строение соединения.

Слайд 7

Ключевые моменты развития масс-спектрометрии

Ключевые моменты развития масс-спектрометрии

Слайд 8

Масс-спектрометрия

Общие положения метода

Структурная масс-спектрометрия основана на разрушении органической молекулы под действием

Масс-спектрометрия Общие положения метода Структурная масс-спектрометрия основана на разрушении органической молекулы под
электронного удара и регистрации массы образующихся осколков

Наименьшая энергия бомбардирующих (ионизующих) электронов, при которой возможно образование из данной молекулы иона, называется энергией (потенциалом) ионизации вещества

Энергия ионизации является мерой прочности, с какой молекула удерживает наименее сильно связанный с ней электрон

Для органических молекул энергия
ионизации составляет 9-12 эВ

М + e → М+• + 2e
М + e → М+• + 2e

Стандартные масс-спектры электронного удара (ЭУ) принято снимать, используя ионизирующие электроны с энергией 70эВ

Слайд 9

Источник ионов

Система разделения ионов

Детектор

Общая схема масс-спектрометра

EI
CI
FAB
MALDI
ESI
Наноспрей

Времяпролетные (TOF)
Квадрупольные (Q)
Ионные ловушки (IT)
Ионно-циклотронного резонанса (ICR-FT)

Микроканальные
пластины (MCP)
Диноды
Магнит

Источник ионов Система разделения ионов Детектор Общая схема масс-спектрометра EI CI FAB
(ICR-FT)

Положительные: - захват протона либо другого катиона (Na, K);
- потеря электрона (катион-радикал).
Отрицательные: - утрата протона;
- захват электрона.

Типы ионов

Только заряженные частицы (в основном катионы) могут ускоряться и фокусироваться электромагнитными полями, поэтому приёмник регистрирует только ионы. Незаряженные радикалы не регистрируются!!

Слайд 10

Образующийся в результате потери одного электрона катион-радикал называется молекулярным ионом

Фрагментация - распад

Образующийся в результате потери одного электрона катион-радикал называется молекулярным ионом Фрагментация -
молекулярного иона на частицы меньшей массы

Фрагментация молекулярного иона приводит:
к образованию других ион-радикалов
к образованию нейтральных молекул
3) к внутримолекулярным перегруппировкам

Чаще всего масс-спектрометрия используется для решения двух задач:

определение молекулярной массы

исследование строения молекулы

идентификация
молекулярного иона

распад молекулярного иона и
анализ образующихся фрагментов

Общие положения метода

Слайд 11

Устройство прибора

1. Образец попадает в прибор через систему газового напуска либо прямого

Устройство прибора 1. Образец попадает в прибор через систему газового напуска либо
введения (шприц).

2. Вещество переводится в газообразное состояние и подается в ионизационную камеру.

3. Пары вещества сталкиваются с перпендикулярным потоком электронов, в результате чего происходит ионизация.

4. Образовавшиеся катионы ускоряются заряженными пластинами и попадают в магнитный масс-анализатор.

5. За счет различной массы однозарядные ионы приобретают различную траекторию, что позволяет получить масс-спектр.

Слайд 12

Общий вид масс-спектра

M+.

молекулярный ион
(самый тяжёлый)

фрагменты

i
(RA)

 

Imax

m/z

Общий вид масс-спектра M+. молекулярный ион (самый тяжёлый) фрагменты i (RA) Imax m/z

Слайд 13

Thermo Fisher Scientific nano-UPLC ESI LTQ-Orbitrap MS system

ABI 4800 MALDI TOF/TOF

Thermo Fisher Scientific nano-UPLC ESI LTQ-Orbitrap MS system ABI 4800 MALDI TOF/TOF
Tandem MS System

Bruker APEX 9.4 Tesla ESI FT-ICR MS System

ABI nano-UPLC ESI
QTRAP-4000 MS system

ABI ESI QSTAR Elite MS System

ABI API QTRAP 5500

Waters CapLC-ESI QTOF Micro MS System

Масс-спектрометры

Слайд 14

Все масс-спектрометры работают при очень низком давлении (высоком вакууме), чтобы уменьшить вероятность

Все масс-спектрометры работают при очень низком давлении (высоком вакууме), чтобы уменьшить вероятность
столкновения ионов с другими молекулами. Столкновения заставляют ионы реагировать, рассеиваться или фрагментироваться. Эти процессы будут мешать получению спектра.
Эксперименты проводятся в условиях высокого вакуума (от 10-2 до 10-6 Па).
Требуется две стадии вакуумирования: механический насос - обеспечивает грубый вакуум ~ 0,1 Па; на второй стадии используются диффузионные или турбомолекулярные насосы для обеспечения высокого вакуума.

Масс-спектрометрия проводится в вакууме!

Слайд 15

Методы ионизации пробы

Газовая фаза
электронная ионизация (EI)
химическая ионизация (CI)
электронный захват (EC)
ионизация в электрическом

Методы ионизации пробы Газовая фаза электронная ионизация (EI) химическая ионизация (CI) электронный
поле (FI)
Жидкая фаза
Фотоионизация при атмосферном давлении (APPI)
электроспрей(APESI)
термоспрей
ионизация при атмосферном давлении (AP)
химическая ионизация при атмосферном давлении (APCI)
Твѐрдая фаза
прямая лазерная десорбция -масс-спектрометрия (LDMS)
матрично-активированная лазерная десорбция/ионизация (MALDI)
масс-спектрометрия вторичных ионов (SIMS)
бомбардировка быстрыми атомами (FAB)
десорбция в электрическом поле (FD)
плазменная десорбция (PD)
ионизация в индуктивно-связанной плазме (ICP)
Термоионизация или поверхностная ионизация
ионизация в тлеющем разряде и искровая ионизация
ионизация в процессе лазерной абляции

Слайд 16

Ионизация электронным ударом

Электронный удар, или, правильнее – электронная ионизация – это ионизация

Ионизация электронным ударом Электронный удар, или, правильнее – электронная ионизация – это
паров вещества потоком электронов, разогнанных в электрическом поле. При этом электрон, пролетая рядом или через молекулу ионизируемого вещества, не захватывается ею, а передает часть своей энергии, что приводит к «возбуждению» молекулы, отрыву от нее одного или нескольких электронов с образованием положительного иона M+, а также, в зависимости от энергии ионизирующих электронов, к разрыву связей в ионизируемой молекуле – к ее фрагментации.

Эффективность ионизации зависит от энергии ионизирующих электронов, максимум эффективности достигается при энергии примерно в 70 эВ

Рис. Зависимость величины ионного тока от энергии ионизирующих электронов

Слайд 17

Схема ионизации электронным ударом

Схема ионизации электронным ударом

Слайд 18

Электронная ионизация

Электронная ионизация

Слайд 19

Ионизация электронным ударом
Энергия в 70 эВ (6754 кДж/моль) для ионизирующих электронов принята

Ионизация электронным ударом Энергия в 70 эВ (6754 кДж/моль) для ионизирующих электронов
за стандарт, приборы, выпускаемые промышленностью, как правило, имеют именно эту величину энергии ионизации.
Также базы данных масс-спектров содержат спектры, записанные на приборах с электронной ионизацией образца и энергией ионизации в 70 эВ.
Масс-спектры в научных изданиях (журналах, монографиях, сборниках трудов конференций) приводятся, как правило, именно с энергией ионизации образца в 70 эВ (исключения редки).

Слайд 20

Ионизация электронным ударом

ПРЕИМУЩЕСТВА ЭЛЕКТРОННОЙ ИОНИЗАЦИИ
1. Наиболее распространенный и простой в реализации метод

Ионизация электронным ударом ПРЕИМУЩЕСТВА ЭЛЕКТРОННОЙ ИОНИЗАЦИИ 1. Наиболее распространенный и простой в
ионизации.
2. Богатый фрагментами масс-спектр соединений, что позволяет проводить структурные исследования.
3. Наличие больших баз данных масс-спектров, позволяющих быстро производить идентификацию соединений.
НЕДОСТАТКИ
1. Не всегда можно получить молекулярный ион.
2. Большая фрагментация образца, иногда трудно по фрагментации проследить направление дальнейших превращений иона.
3. Невозможность работы с образцами, которые нельзя перевести в пары (биомолекулы, синтетические полимеры).

Слайд 21

Химическая ионизация (CI, Chemical Ionization)

Химическая ионизация – второй по распространенности метод ионизации

Химическая ионизация (CI, Chemical Ionization) Химическая ионизация – второй по распространенности метод
в настоящее время. Суть метода заключается в том, что ионизация образца происходит не пучком электронов, как в случае электронной ионизации, а пучком предварительно ионизированных молекул газа, например, метана или аммиака. Ионизация молекул газа происходит при помощи электронной ионизации при 150-200 эВ и дальнейшего химического превращения газа-ионизатора. На примере метана:
CH4 → CH4+⋅
CH4+⋅ + CH4 → CH5+ + CH3⋅
Сталкиваясь с молекулами образца, ионизированные молекулы газа передают свой заряд в виде протона:
M + CH5+ → MH+ + CH4
Далее протонированная молекула образца выталкивается электрическим полем в сторону масс-анализатора.
Достоинства:
1. Мягкий метод ионизации, молекуле образца передается около 5 эВ избыточной энергии, что препятствует процессам фрагментации и позволяет подвергать анализу нестойкие молекулы.
2. Интенсивный пик молекулярного иона.
Недостатки:
1. Отсутствие фрагментации, что не позволяет судить о структуре вещества и сравнить спектр с базами масс-спектральных данных.
2. Возможно провести анализ только тех соединений, которые можно перенести в газовую фазу (испарить).

Слайд 22

Электроспрей (ESI, Electro Spray Ionization)

Электроспрей (электрораспыление) – метод ионизации, суть которого заключается

Электроспрей (ESI, Electro Spray Ionization) Электроспрей (электрораспыление) – метод ионизации, суть которого
в следующем – вещество на ионизацию поступает в растворе полярного растворителя (им может быть вода, ацетонитрил, метанол и т.д.), при этом в растворе присутствуют катионы водорода или щелочных металлов, натрия или калия. Небольшая капля раствора подается в металлический специальный капилляр-«небьюлайзер» («распылитель»), к которому одновременно приложено высокое (несколько кВ) электрическое напряжение, в результате чего капля с раствором образца, срываясь с конца капилляра, имеет положительный заряд. Далее, продвигаясь в электрическом поле, капля испаряется под действием нагретого потока инертного газа (чаще всего азота). Объем капли уменьшается, заряд ее поверхностный растет – и капля «взрывается» на ряд мелких капель, заряженных положительно, и продолжающих испарять молекулы растворителя под действием нагретого сухого инертного газа.

Слайд 23

Далее через узкие отверстия сепараторов, где происходит постепенное снижение давления с примерно

Далее через узкие отверстия сепараторов, где происходит постепенное снижение давления с примерно
атмосферного до глубокого вакуума, ионизированные частицы, состоящие из молекул исследуемого вещества и катиона (H+, Na+, K+), попадают в ионную оптику:

Рис. Z-образная геометрия движения потока образца в источнике ионов, работающем по принципу электрораспыления.

Слайд 24

ESI – электрораспыление и ионизация

Растворители:
вода, ацетонитрил, метанол

Анализируемое вещество
подается в растворе

ESI – электрораспыление и ионизация Растворители: вода, ацетонитрил, метанол Анализируемое вещество подается
через капилляр с поданым на него напряжением.

несколько последовательных
«упариваний-взрывов» микрокапель

В результате получаются
многозарядные газофазные ионы, захватившие на себя разное
количество протонов,
вплоть до максимально возможного.

Слайд 25

Схема электрораспылительного источника ионов

Схема электрораспылительного источника ионов

Слайд 26

Электроспрей (ESI, Electro Spray Ionization)

Достоинства:
1. Возможность работать с веществами, которые нельзя перевести

Электроспрей (ESI, Electro Spray Ionization) Достоинства: 1. Возможность работать с веществами, которые
в газовую фазу
2. Метод практически идеально подходит для стыковки масс-спектрометра и жидкостного хроматографа
3. Возможность анализа крупных (до нескольких миллионов дальтон) молекул
4. Мягкое (низкоэнергетическое) ионизационное воздействие
Недостатки:
1. Вещество должно быть растворимо с полярных растворителях
2. Масс-спектр малоинформативен, как правило, присутствуют лишь пики комплексов молекулярного иона с катионом (H+, Na+, K+), многозарядных ионов таких комплексов

Слайд 27

МАТРИЦА:
* Поглощает энегрию лазерного излучения,
“вскипая”, увлекает в газовую фазу
молекулы

МАТРИЦА: * Поглощает энегрию лазерного излучения, “вскипая”, увлекает в газовую фазу молекулы
анализируемого вещества
* Способствует ионизации

Матрицы для УФ лазера (336нм)

Лазер: 2 нс, 50-300 мкДж/имп , 50 мкм

Анализируемое вещество
(раствор 10-4 -10-8 М, <1 мкл)
смешивается с матрицей
(раствор 10-1 -10-2 М, <1 мкл),
высушивается на подложке, образуя кристаллоиды

MALDI - matrix assisted laser desorption / ionization лазерная десорбция и ионизация в присутствии вспомогательного вещества - матрицы

Слайд 28

Лазерная десорбция (MALDI, Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization)

Матричная лазерная десорбция – метод, при котором

Лазерная десорбция (MALDI, Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization) Матричная лазерная десорбция – метод, при
исследуемое вещество помещают в «матрицу» - перемешивают с веществом, имеющим меньший молекулярный вес и отличающимся высокой способностью поглощать лазерное излучение (например, коричная кислота, 3-гидроксипиколиновая кислота, 6,7-гидроксикумарин и т.д.).

Перемешивание происходит при помощи растворения вещества-образца и вещества матрицы в одном растворителе и последующем испарении растворителя на специальной подложке.

Слайд 29

Далее подложка с матрицей помещается в ионный источник, где в качестве ионизатора

Далее подложка с матрицей помещается в ионный источник, где в качестве ионизатора
выступает короткий импульс (0.1 нс…1 мкс) лазерного излучения (например, азотные лазеры с длиной волны 337 нм). Луч, попадая на подложку с матрицей, вызывает испарение вещества матрицы, молекулы которой ухватывают за собой молекулы исследуемого вещества. В процессе испарения часть молекул ионизируется и далее увлекается электрическим полем в сторону анализатора.

Слайд 30

Лазерная десорбция (MALDI, Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization)

Достоинства:
1. Возможность анализа крупных молекул (массой до

Лазерная десорбция (MALDI, Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization) Достоинства: 1. Возможность анализа крупных молекул
100 000 дальтон и выше)
2. Мягкая ионизация образца
Недостатки:
1. Малоинформативный масс-спектр – присутствуют лишь пики молекулярного иона и его «мультимеров» - частиц, состоящих из нескольких молекул образца с зарядом +1
2. Долгая пробоподготовка и необходимость подбора условий под образец - подбирать вещество для матрицы

Слайд 31

* Оба метода ионизации требуют высокой химической чистоты
анализируемого вещества.
* Диапазон

* Оба метода ионизации требуют высокой химической чистоты анализируемого вещества. * Диапазон
концентрации аналита при ESI и MALDI 10-3 – 10-7 M.
* Поскольку разные вещества (например, пептиды) обладают разной
способностью к ионизации (захвату протона либо другого катиона),
то невозможно делать выводы о количественном соотношении
компонентов сложной смеси на основании высот пиков в спектре.

При ESI образуется непрерывный поток ионов,
при MALDI - сильно ограниченный во времени (до 10 нс) пакет ионов.

При ESI анализу подлежит более 10 фемтомолей вещества,
при MALDI - более 1 фемтомоля вещества.

При ESI образуются ионы m/z 0-5000,
возможно измерение белков до ~50 000 Да.
При MALDI возможно измерение белков до ~200 000 Да,
диапазон измеряемых масс ограничен снизу до ~500 Да
из-за присутствия в спектрах пиков матрицы.

ESI является более “мягким” способом ионизации, чем MALDI.

Замечания о ESI и MALDI:

Слайд 32

Квадрупольный анализатор

Ионная ловушка

Магнитный анализатор

Времяпролетный масс-анализатор

СИСТЕМЫ РАЗДЕЛЕНИЯ ИОНОВ

Квадрупольный анализатор Ионная ловушка Магнитный анализатор Времяпролетный масс-анализатор СИСТЕМЫ РАЗДЕЛЕНИЯ ИОНОВ

Слайд 33

1. Лимит массы частицы
2. Скорость анализа
3. Пропускание (отношение количества ионов достигших детектора

1. Лимит массы частицы 2. Скорость анализа 3. Пропускание (отношение количества ионов
к числу ионов, поступивших в масс-анализатор
4. Точность, аккуратность (ppm)
5. Разрешение.

5 главных характеристик масс-анализатора

Слайд 34

2 пика считаются разделенными, если ложбина между ними составляет 10% от пика

2 пика считаются разделенными, если ложбина между ними составляет 10% от пика
с меньшей интенсивностью, если используется магнитный или циклотронный резонанс (ICR) и 50% когда используется квадрупольный, ионная ловушка, TOF и другие.

R=m/∆m

Термины Низкое разрешение и высокое разрешение обычно используются для описания анализаторов, обладающих разрешающей способностью менее или более 10 000 (FWHM), соответственно.
Полная ширина на уровне половинной амплитуды (англ. FWHM — full width at half maximum) — полная ширина, рассчитанная как разница между максимальным и минимальным значениями аргумента функции, взятыми на уровне равном половине её максимального значения.

Слайд 35

Разрешение

250.1933

250.1807

m/z

Два близких пика с одинаковой интенсивностью

высота

ложбина

< 10%

250.1933

R =

250.1933-250.1807

= 20,000

C16H26O2

C15H24NO2

Разрешение 250.1933 250.1807 m/z Два близких пика с одинаковой интенсивностью высота ложбина

Слайд 36

Масс-спектрометрия высокого разрешения

1Н 1,00782
14N 14,0031
16O 15,9949

CO 27,9949
C2H4 28,0313
N2 28,0062

различимы на масс-спектрометрах
высокого разрешения

Используют приборы с двойной фокусировкой.

Масс-спектрометрия высокого разрешения 1Н 1,00782 14N 14,0031 16O 15,9949 CO 27,9949 C2H4

Слайд 38

Магнитный анализатор

Рис. Схема масс-спектрометра с магнитным анализатором

Исторически первый тип анализатора (Демпстер, 1918

Магнитный анализатор Рис. Схема масс-спектрометра с магнитным анализатором Исторически первый тип анализатора
г.). Физические основы действия – изменение траектории заряженной частицы под действием магнитного поля.

Слайд 39

Магнитный масс-анализатор

 

Кинетическая энергия ионов определяется потенциалом ускоряющих пластин.

Траекторию определяет сила Лоренца, зависящая

Магнитный масс-анализатор Кинетическая энергия ионов определяется потенциалом ускоряющих пластин. Траекторию определяет сила
от массы иона.

Регистрируемой величиной в приборе является соотношение m/z. Производится также автоматический подсчёт числа ионов для каждого m/z.

Слайд 40

Электрический (электростатический) анализатор

Электростатический анализатор по принципу действия примерно аналогичен магнитному, только роль

Электрический (электростатический) анализатор Электростатический анализатор по принципу действия примерно аналогичен магнитному, только
магнитного поля у него выполняет электрическое поле (ионы движутся между двумя противоположно заряженными электродами), которое также может отклонять ионы тем или иным образом, причем ионы с разными массами будут отклоняться на разные углы (иметь другие траектории движения). Попадая в такой анализатор, ион движется по круговой орбите с радиусом R таким образом, чтобы сила электрического поля уравновешивалась центробежной силой:

Варьируя величину поля, возможно пропускать через анализатор ионы с разным значением масс, т.е. производить развертку масс-спектра.

Слайд 41

Электрический (электростатический) анализатор

Как правило, этот вид анализатора применяется в дополнение к магнитному

Электрический (электростатический) анализатор Как правило, этот вид анализатора применяется в дополнение к
анализатору для обеспечения большего разрешения прибора (такие приборы называются «приборами с двойной фокусировкой») и для облегчения измерения точных масс, т.к. электрическое поле возможно варьировать более точно, чем магнитное.

Рис. Схема масс-спектрометра с двойной фокусировкой ионов (БП – бесполевое пространство

Слайд 42

Квадрупольный анализатор

Квадрупольный анализатор представляет собой систему из четырех стержней-электродов, к которым приложены

Квадрупольный анализатор Квадрупольный анализатор представляет собой систему из четырех стержней-электродов, к которым
высокочастотные переменное и постоянные напряжения, изменяющиеся во времени как U + V(cos ωt), противоположные стержни заряжены одинаково:

Рис. Квадрупольный анализатор, поперечный (слева) и продольный (справа) разрезы. Ионный пучок движется от источника ионов (ИИ) по направлению к детектору (Д).

Слайд 43

Квадрупольный анализатор

Принцип работы анализатора состоит в том, что под действием постоянного и

Квадрупольный анализатор Принцип работы анализатора состоит в том, что под действием постоянного
переменного электрических полей заряженные частицы с массой М испытывают стабильные колебания и могут пройти через квадрупольный фильтр (т.е. между электродами вдоль осевой линии) только при определенных значениях постоянного и переменного напряжения на электродах. Частицы с другими массами при этом движутся слишком далеко от главной оси системы и, сталкиваясь со стержнями, выбывают из потока. Меняя напряжения на стержнях, возможно производить развертку масс-спектра.

Слайд 44

Квадрупольный анализатор (Q)

Квадруполь легко управляется компьютером
Имеет хороший динамический диапазон
Стыкуется со всеми системами

Квадрупольный анализатор (Q) Квадруполь легко управляется компьютером Имеет хороший динамический диапазон Стыкуется
ввода
Способен без модифицирования разделять и положительные, и отрицательные ионы
Быстрота сканирования (полный спектр за 5 секунд)
Небольшие размеры
Дешевизна
Возможность работы при повышенном (до 5 х 10~5 мм рт.ст.) давлении

Слайд 45

Времяпролетный анализатор (TOF, Time Of Flight)

Рис. Схема принципа действия времяпролетного масс-спектрометра, показано

Времяпролетный анализатор (TOF, Time Of Flight) Рис. Схема принципа действия времяпролетного масс-спектрометра,
разделение ионов с массой М1 и М2 на пути от ионного источника (ИИ) до детектора (Д)

Времяпролетный анализатор масс основан на простом принципе – скорость разогнанных ионов обратно пропорциональна их массам:

или

где V – ускоряющее напряжение. Если ионы движутся в полой трубе, где отсутствует электрическое поле, то детектора они достигают в порядке увеличения своей массы.

Слайд 46

Времяпролетный анализатор (TOF, Time Of Flight)

Времяпролетный анализатор (TOF, Time Of Flight)

Слайд 47

Времяпролетный анализатор (ТОF)

имеет более высокую чувствительность по сравнению со сканирующими приборами;
имеет очень

Времяпролетный анализатор (ТОF) имеет более высокую чувствительность по сравнению со сканирующими приборами;
высокую скорость записи спектра (несколько сот спектров в секунду);
имеет практически неограниченный диапазон масс;
имеет разрешающую способность более 10000;
может работать с самыми разнообразными источниками ионов;
является идеальным вторым анализатором для работы в режиме тандемной масс-спектрометрии;
относительно небольшие размеры.

Слайд 48

Детекторы

Электрометр (коллектор ионов)
Вторично-электронный умножитель (ВЭУ)
Канальный ВЭУ
Микроканальная пластина МСР
ВЭУ с конверсионным

Детекторы Электрометр (коллектор ионов) Вторично-электронный умножитель (ВЭУ) Канальный ВЭУ Микроканальная пластина МСР ВЭУ с конверсионным динодом
динодом

Слайд 49

Детектирование ионов – электронный умножитель

Схема действия электронного умножителя (ЭУ):

Электронный умножитель масс-спектрометра Thermo

Детектирование ионов – электронный умножитель Схема действия электронного умножителя (ЭУ): Электронный умножитель
Electron DFS:

Электронный умножитель (ЭУ) - электронное устройство для усиления потока электронов на основе вторичной электронной эмиссии.
В ЭУ на дискретных динодах представляют собой трубку (канал) из стекла с высоким содержанием свинца либо из керамики — прямую или изогнутую. К трубке прикладывают напряжение и в результате в её полости возникает электростатическое поле. Под действием этого поля попавшие в канал электроны ускоряются и, соударяясь со стенками, вызывают вторичную электронную эмиссию.

Слайд 50

Интерпретация масс-спектров

С чего начинать процесс расшифровки?

Информация об образце
Спектральная база данных
Анализ вида спектра:
Параметры

Интерпретация масс-спектров С чего начинать процесс расшифровки? Информация об образце Спектральная база
съемки
Наиболее интенсивные пики
Характерные группы пиков
4. Установить молекулярный ион

Если спектр характеризуется большим числом фрагментов, пики которых имеют все большую интенсивность при движении вниз по шкале масс, скорее всего это алифатическое соединение

Редкие интенсивные пики характерны для ароматических структур

Слайд 51

Определение молекулярного иона

Необходимые условия, которым должен удовлетворять молекулярный ион:

Иметь самую большую молекулярную

Определение молекулярного иона Необходимые условия, которым должен удовлетворять молекулярный ион: Иметь самую
массу в спектре
Быть нечетноэлектронным (определение ненасыщенности)
Быть способным образовывать важнейшие ионы с большой массой за счет выброса нейтральных частиц
Включать все элементы, наличие которых в образце можно увидеть по фрагментным ионам

Степень ненасыщенности R (число кратных связей и циклов в ионе):

U – целое число, то ион нечетноэлектронный, U – дробь, ион четноэлектронный

Если ненасыщенный, при этом нечетноэлектронный, то может быть молекулярным ионом

Расчет ненасыщенности

Азотное правило: если в молекуле содержится нечетное число атомов азота, то молекулярный ион имеет нечетную массу.
? если масса молекулярного иона четная, то скорее всего в молекуле нет атомов азота (либо их два).

Формула: U=(2C+2+N-X-H)/2
C-количество атомов углерода
N- количество атомов азота
X- количество атомов галогена
H- количество атомов водорода

Слайд 52

Определение молекулярного иона

Обычно молекулярный ион легко отщепляет:
Молекулы CO, CO2, H2O, C2H4, HHal
Радикалы

Определение молекулярного иона Обычно молекулярный ион легко отщепляет: Молекулы CO, CO2, H2O,
Alk., H., Hal., OH.

Потери из молекулярного иона от 5 до 14 или от 21 до 25 а.е.м., приводящие к возникновению интенсивных пиков ионов, крайне маловероятны

Например: в масс-спектре самый тяжелый ион 120, следующий за ним – 112.
Вывод: ион 120 – не молекулярный, а фрагментный

Слайд 53

Интерпретация спектра

i

35Cl 1

37Cl 0,324

M M+2

Изотопные рисунки

Наличие галогенов в молекуле определяется по характерным

Интерпретация спектра i 35Cl 1 37Cl 0,324 M M+2 Изотопные рисунки Наличие
рисункам в спектре, которые проявляются за счет того, что распространенность тяжелых изотопов хлора и брома достаточно высока.

79Br 1

81Br 0,981

M M+2

35Cl + 35Cl

35Cl + 37Cl

M M+2 M+4

37Cl + 37Cl

m/z

Слайд 54

В масс‑спектре N‑(п‑бромфенил)ацетамида с ионизацией электронным ударом наблюдаются два пика 213 и

В масс‑спектре N‑(п‑бромфенил)ацетамида с ионизацией электронным ударом наблюдаются два пика 213 и
215 примерно одинаковой интенсивности. Два пика осколочных ионов (171/173) имеют совершенно тот же вид. Почему в спектре наблюдаются пары сигналов 213/215 и 171/173?

Слайд 55

Интерпретация спектра

i

М+.

13С

M M+1

 

в общем

 

в молекуле
(n – число атомов С)

Изотопы углерода

Практически каждый пик

Интерпретация спектра i М+. 13С M M+1 в общем в молекуле (n
в спектре сопровождают более мелкие изотопные пики углерода. По соотношению основного пика и изотопного можно вычислить соответствующее число атомов углерода.

m/z

Слайд 56

Определение числа атомов углерода по структуре пика молекулярного иона

Для определения числа атомов

Определение числа атомов углерода по структуре пика молекулярного иона Для определения числа
углерода в молекуле по масс-спектру необходимо разделить интенсивность пика М+1 в процентах от М на 1.1. Полученное число означает максимально возможное число атомов углерода в молекуле.
Большое количество атомов углерода в молекуле приводит к увеличению вероятности одновременного присутствия в молекуле 2 или большего числа атомов 13С, что вызывает рост интенсивностей пиков изотопных ионов [M+2], [M+3] и т.д.
Для каждого атома другого элемента, присутствующего в ионе, необходимо увеличить интенсивность пика А+1 на 0.37% (для азота), на 0.04% (для кислорода), на 0.8% (для серы).

Пример: M+ пик 78 и M+1 79 с интенсивностью 7% :
#C x 1.1 = 7%
#C = 7%/1.1 = ~6 Вывод: молекула содержит 6 атомов углерода

Слайд 57

ВНТ – вещество, которое добавляют в пищевые продукты для защиты витаминов А

ВНТ – вещество, которое добавляют в пищевые продукты для защиты витаминов А
и Е от окисления. Ему присвоен Е‑индекс 321. Оно используется, например, в жевательных резинках. На масс-спектре вещества есть пик молекулярного иона с массой 220 и интенсивностью 24%. Рассчитайте ожидаемую интенсивность изотопного пика 13С.

Слайд 58

Основные правила и подходы к интерпретации
масс-спектров

Концепция стабильности ионов и нейтральных частиц
Концепция

Основные правила и подходы к интерпретации масс-спектров Концепция стабильности ионов и нейтральных
локализации заряда и неспаренного электрона

Наиболее признанные качественные теории масс-спектрометрического распада:

Концепция стабильности ионов и нейтральных частиц

Эффективность фрагментации определяется устойчивостью образующихся продуктов

Правило выброса максимального алкильного радикала

Интенсивность пика ионов, образующихся при выбросе максимального радикала – наивысшая, при выбросе минимального радикала - низшая

Слайд 59

Фрагментные (осколочные) ионы

Все важнейшие фрагментные ионы делятся на:
Наиболее тяжелые ионы, образующиеся из

Фрагментные (осколочные) ионы Все важнейшие фрагментные ионы делятся на: Наиболее тяжелые ионы,
М+. в результате выброса простейших частиц (важны для установления путей фрагментации)
Ионы, характеризующиеся наиболее интенсивными пиками в спектре
Характерные серии ионов, различающихся на гомологическую разность

Гомологические серии ионов

Гомологические серии ионов с низкой массой говорят о наличии гетероатомов, степени ненасыщенности, о классе соединения

Алкановая серия: 15, 29, 43, 57, 71, 85…
Спирты, простые эфиры: 31, 45, 59, 73, 87…
Алкилбензолы: 38, 39, 50-52, 63-65, 75-78, 91, 105, 119

Если степень ненасыщенности молекулы или количество функциональных групп велико, значимые серии ионов с низкой массой, отстоящих друг от друга на СН2-группу, в спектре отсутствуют

Слайд 60

Потеря нейтральных частиц и радикалов

Самые распространенные частицы:
Потеря H, CH3, H2O (кислородсодержащие

Потеря нейтральных частиц и радикалов Самые распространенные частицы: Потеря H, CH3, H2O
соединения)
HC ≡ CH (ароматические соединения)
HC≡N (азотсодержащие ароматические соединения)
С=O, CH2=CH2 (оба 28)
Этильный радикал (29)
Метокси радикал (31)
Cl и HCl (35,36)
Ацетил (43)

Слайд 61

Перегруппировочные ионы

Ионы, образующиеся из первоначальной молекулы, путем перестройки ее геометрии. Наиболее распространена

Перегруппировочные ионы Ионы, образующиеся из первоначальной молекулы, путем перестройки ее геометрии. Наиболее
перегруппировка Мак-Лафферти:

Условия протекания перегруппировки Мак-Лафферти:
1) Желательно наличие гетероатома в молекуле (необязательно).
2) наличие π-системы (обычно двойная связь).
3) водород у γ-атома (γ-положение по отношению к группе С-Х, где Х – гетероатом).

R = углеводородный радикал, Y = H, R, OH, OR, NHR, NR2

Заключается в миграции атома Н в катион-радикале (мол. ионе) исследуемого соед. от γ-С к атому X через 6-членное переходное состояние

Слайд 62

Схемы фрагментации
Схема фрагментации отражает основные характеристические направления распада молекулярного иона, а также

Схемы фрагментации Схема фрагментации отражает основные характеристические направления распада молекулярного иона, а
состав фрагментных ионов, их структуру по возможности, взаимосвязь этих ионов друг с другом, удобно привести относительные интенсивности пиков.
Схема 1.

Слайд 63

Схема 2.

Схема 2.

Слайд 64

Масс-спектр (NH4+)2[5-NATZ]2- из работы Илюшин М.А., Терпигорев А.Н., Целинский И.В. Влияние изомерного

Масс-спектр (NH4+)2[5-NATZ]2- из работы Илюшин М.А., Терпигорев А.Н., Целинский И.В. Влияние изомерного
строения (N-нитроамино)тетразолов на свойства их солей // ЖОХ. 1999. Т. 69. Вып. 10. С. 1727-1730.

5-нитраминотетразол (5-NATZ):

Вариант представления фрагментации

Слайд 65

Большинство анализов олиго- и полипептидов с помощью масс-спектрометрии используют матричную лазерную десорбционную

Большинство анализов олиго- и полипептидов с помощью масс-спектрометрии используют матричную лазерную десорбционную
ионизацию (MALDI), обычно связанную с времяпролетным (TOF) масс-анализатором. MALDI является методом мягкой ионизации, производит заряженные молекулы с небольшой фрагментацией. На рисунке приведен MALDI-TOF спектр лизоцима (молекулярная масса 14306 Да).

Слайд 66

21 499 пиков
( различных химических соединений )

Нефть Европы

Масс – спектр
неполярных компонентов

21 499 пиков ( различных химических соединений ) Нефть Европы Масс – спектр неполярных компонентов

Слайд 67

m/z

1200

1000

800

600

400

Легкая нефть

Тяжелая нефть

~15 000 пиков

~30 000 пиков

Масс - спектры

m/z 1200 1000 800 600 400 Легкая нефть Тяжелая нефть ~15 000

Слайд 68

Комбинации масс-спектрометра с хроматографами

GCMS – Gas Chromatography / Mass Spectrometry
LCMS – Liquid

Комбинации масс-спектрометра с хроматографами GCMS – Gas Chromatography / Mass Spectrometry LCMS
Chromatography / Mass Spectrometry

Слайд 69

Времяпролетный масс-спектрометр высокого разрешения Bruker micrOTOF-Q с жидкостным хроматографом Agilent 1100


Времяпролетный масс-спектрометр высокого разрешения Bruker micrOTOF-Q с жидкостным хроматографом Agilent 1100

Слайд 70

Примеры использования масс-спектрометрии

Исследователи из Нидерландов и США использовали масс-спектрометрию [quadrupole time-of-flight (QToF

Примеры использования масс-спектрометрии Исследователи из Нидерландов и США использовали масс-спектрометрию [quadrupole time-of-flight
MS)] для изучения неповрежденной капсиды батериофага – вируса, который инфицирует бактерии. Новую работу вполне можно считать рекордом в плане размеров и массы частицы, которая была изучена (18 мегадальтон).

Источник: Angew. Chem., Int. Ed., 2013, DOI: 10.1002/anie.201210197

Экспериментально было получено значение массы 17.942 мегадальтон с точностью плюс/минус 0.004 мегадальтон. Исследователи предполагают, что модификация метода, как, например, более эффективная десольватация объекта, позволит увеличить разрешение спектрометрии QToF MS и исследовать комплексы белков и другие вирусные частицы с массой 20 мегадальтон с хорошим разрешением

Слайд 71

Исследователи из США разработали методику для анализа красителей, использовавшихся для изготовления текстильных

Исследователи из США разработали методику для анализа красителей, использовавшихся для изготовления текстильных
артефактов. Новый способ анализа поможет музеям подбирать составы для сохранения предметов старины, и сможет подсказать историкам, какими технологиями пользовались наши предки

Кэти Селвиус ДеРу и Рут Энн Армитаж для анализа четырёх наиболее распространенных волокон – хлопка, шерсти, льна и шелка – использовали методику масс-спектрометрии непосредственного анализа в режиме реального времени пролета осколков [direct analysis in real time-time-of-flight mass spectrometry (DART-MS)]. Для окраски тканей требуются крайне незначительные количества красителя, поэтому при наличии крошечных образцов такой ткани, анализ красящего вещества представляет собой непростую задачу.
Масс-спектрометрия DART-MS представляет собой методику мягкой ионизации, которая ранее применялась для использования в криминалистике, а также анализа пищевых и лекарственных продуктов. Исследователи тестировали DART-MS на растворах трёх наиболее распространённых красителей, обнаруженных в артефактах, хранящихся в Институте Искусств Детройта – квертецина, индиготина и ализарина, а также на модельных волокнах, окрашенных этими соединениями. Разработанный подход позволил исследователям быстро и точно проводить определения красителей в небольших образцах окрашенных тканей. Возможность безошибочно идентифицировать флавоноидные, индигоидные и антрахиноновые красители позволяет говорить о том, что новый аналитический метод окажется полезным для определения органических красителей в древних предметах культурного наследия – исторической одежде, мягкой мебели, куклах и даже рукописях.

Источник: Anal. Chem., 2011, DOI: 10.1021/ac201747s 

Слайд 72

Последняя работа европейских исследователей, при выполнении которой они применяли методику масс-спектрометрии, позволила

Последняя работа европейских исследователей, при выполнении которой они применяли методику масс-спектрометрии, позволила
им обнаружить ранее неизвестный ингредиент в пигментах, применявшихся голландским живописцем XVII века – Рембрандтом ван Рейном.

Для изучения деталей состава полотна «Портрет Николаса Ван Бамбека» исследователи применили масс-спектрометрию. (Рисунок из Anal. Chem., DOI: 10.1021/ac1017748)

В одном из слоев краски на портрете реставраторы и аналитики обнаружили крахмал, ингредиент, который ранее не встречался в составах прежде изученных полотен голландского живописца.
Для получения более детальной химической информации исследователи решили использовать сравнительно новый для изучения предметов подход – масс-спектрометрию вторичных ионов [secondary ion mass spectrometry (TOF-SIMS)].
Работая с небольшим образцом темной основы полотна, исследователи подтвердили, что во втором слое грунтовки (слое, на котором перед работой маслом и кистью живописец делал наброски карандашом) содержался крахмал. Оценка формы и размеры зерен крахмала позволила определить, что Рембрандт использовал пшеничный крахмал. Исследователи планируют изучить еще одно полотно великого голландца, написанное также в 1641 – «Портрет Агаты Бас» - они собираются выяснить, не применялся ли Рембрандтом крахмал для изготовления грунтовки и в этом случае.

Слайд 73

Кокаин в воздухе

J. Sep. Sci. 2007, 30, 1930 – 1935
DOI 10.1002/jssc.200700039

Анализ аэрозоля

Кокаин в воздухе J. Sep. Sci. 2007, 30, 1930 – 1935 DOI
в Риме и Таранто методом HRGC–MS показал содержание кокаина, временами превышающее 100 пг/м3

Кокаин в газировке

В 2009 году в газировке Red Bull был обнаружен кокаин.
Анализ различных напитков был проведен с помощью nanoEESI-MS/MS: Pepsi, Coca-Cola, Red Bull.

Источник: J. Am Soc Mass Spectrom 2010, 21, 290–293

Содержание кокаина:
Red Bull: 2.1*10-11 г/мл
Coca Cola: 6.5* 10-12 г/мл
Pepsi Cola: 6.2*10-12 г/мл

Имя файла: Основы-постановки-научного-эксперимента.-Масс-спектрометрия.-(Лекция-9).pptx
Количество просмотров: 77
Количество скачиваний: 0