Cell cycle control

Cell cycle

Cyclin expression
D
E
A
B

Cyclin
cdk regulation
1) The presence of the cyclin
2) Activating threonine
phosphorylation in the kinase
domain by CyH/cdk7
2) Inhibitory tyrosine phosphorylation on N-terminus
by wee1 (dephosphorylation by cdc25 A, B, C)
4) The presence of the cdk inhibitors
5) Nuclear vs. cytoplasmic location
cdk

Cyclin
cdk regulation
1) The presence of the cyclin
cdk
Transcriptional regulation
AP-1, Ets-fam., LEF-β-catenin, STAT3, NFκB, CREB for CyD
E2F, myc (indirect?) for CyE
E2F, CREB for CyA
b) Proteasomal degradation
GSK3β for CyD. SCF complex.
APC for CyB in methaphase checkpoint
c) Translation and mRNA satbility
CyD

cdk inhibitors
1) Ink4 family (p15, p16, p18, p19)
2) KIP/CIP family (p21waf1/CIP, p27Kip1, p57Kip2)

Progression through G1
CyD/cdk4(6)
CyE/cdk2
CyA/cdk2
Rb/E2F
Rb + E2F
P
p27Kip1
S phase genes
P16 etc.
Mitogenic
stimuli
…
…
p21Waf1
Stress

Progression through G1

Cyclin E regulation

Cyclin E targets

Cyclin E targets

Replication lycensing

Replication lycensing

Replication initiation

Geminin and lycensing regulation

Clasters of replication

Progression through G2 to mitosis

Progression through G2 to mitosis

Progression through G2 to mitosis

APC/C

Integration of signaling pathways in
cell cycle control

Ras connection to cell cycle

Proliferative stimuli
Serum
Growth factors, some cytokines
Some GPCR ligands (especially LPA)
Cell-matrix adhesion
Steroid hormones

Proliferative pathways
GF receptors
Non-receptor tyrosine kinases
Ras
ERK, sometimes JNK
TCF, SRF, AP-1 (c-jun, c-fos) transcription factors
PI-3 kinase
PKC (various isoforms), often Ca
Moderate ROS
PKA (not always)
Integrins
Actin membrane targeting and polymerisation stimulators
Rho family GTPases
c-myc, E2F
β-catenin, STAT3, STAT5

Anti-proliferative stimuli
Proliferative signals (serum, GF, adhesion etc) withdrawal
Cell-cell adhesion
TGFβ (not always)
Some cytokines (interferons), sometimes GFs
DNA damage, telomere shortening
Hyperosmolarity, UV, pro- or antioxidants, heat shock
Some GPCR ligands
Inhibitors of DNA or dNTP synthesis
Tubulin-reactive drugs
Tyrosine kinase inhibitors
Oncogene activation (not always)

Anti-proliferative pathways
p53
High and prolonged Ras or ERK
STAT1, STAT2
Smad2, 3, 4
GSK3β
PKA (sometimes), PKC δ
JNK, p38
Telomere shortening
Bcl-2

Cell cycle dependent p53 induction
E2F-1
p19ARF
mdm2
p53
p21waf
Cy/cdk

Cell senescence

Cell senescence

Cell senescence inducers

Telomere signal

Signaling to senescence

Replicative (telomere-dependent) senescence

Premature (accelerated, stress- and oncogene-induced, telomere-independent) senescence

Cell cycle and apoptosis

Proliferation and apoptosis

Non-apoptotic functions of apoptotic proteins

Integration of signaling pathways in apoptosis control

Signal-regulated elements
of the apoptotic machinery
Bcl-2 family (Bax, Bak, Bcl-2, Mcl-1, Bcl-XL, Bcl-XS,
Bad, Bid, Puma, Noxa etc.; expression, proteasome
degradation, activation, processing, phosphorylation,
localisation)
Death receptors (TNFαR-family) and death ligands
(expression, plasma membrane localisation, processing)
Procaspases (expression)
Caspase inhibitors (IAPs, XIAP, survivin)
MPT inducers
hsp70

Pro-apoptotic stimuli
Survival signals (serum, GF, adhesion etc) withdrawal
FasL, TRIAL, TNFα etc.
TCR, BRC
Some cytokines (interferons), sometimes GFs
DNA damage
Hyper- or hypoosmolarity, UV, pro- or antioxidants,
heat shock
Kinase inhibitors
Some GPCR ligands

Pro-apoptotic pathways
p53
p38, JNK (not always), upstream kinases (MEKK)
Crk
Ras (not always)
GSK3β
FoxO
PKCδ
STAT1, STAT2
Ceramide

Anti-apoptotic stimuli
Serum
Growth factors (especially IGF-1 and insulin),
some cytokines
Cell-matrix adhesion
TNFα-family (all DD(-) receptors + some DD(+) )
CD19, CD28 etc. ligands
Some GPCR ligands
Caspase inhibitors

Anti-apoptotic pathways
PI-3 kinase, Akt-PKB
NFκB (not always)
ERK (not always), Raf, JNK (sometimes); AP-1
Ras (not always)
Most PKC isoforms
PKA
hsp70, hsp90, hsp27
STAT3, STAT5
p21waf

Методы в исследовании
передачи сигнала

Методы в исследовании
передачи сигнала
и артефакты
Everybody lies.
House M.D.

Добрый совет №1
Помните, что не все статьи и опубликованные результаты достоверны.
Ориентируйтесь на цитирование и мнение ведущих специалистов.

Как доказать участие сигнальной молекулы в клеточном процессе
в ответ на стимул
Стимул
Молекула-
кандидат
Результат
(клеточный
процесс)
?
Известно, что данный стимул приводит к данному результату. Нужно выяснить, участвует ли в передаче сигнала от стимула на результат молекула-кандидат, и насколько она необходима.

1) Сигнальная молекула активируется (дезактивируется)/
накапливается(уменьшается в количестве)/
меняет локализацию в ответ на данный стимул
(далее рассматриваем только активацию)
2) Ингибирование активности/активации данной молекулы (ингибиторы самой молекулы или вышестоящих молекул, ингибирующие антитела, siRNA/shRNA, нокаут по данному гену) препятствует ответу на данный стимул.
2а) В идеале требуется провести реактивацию/обратную трансфекцию
3) Активация данной молекулы (при действии другого стимула/искусственного активатора/оверэкспрессии/
экспрессии конститутивно-активной формы) вызывает требуемый ответ.
3а) В идеале хорошо дополнительно заингибировать эту активацию/накопление

Стимул
Молекула-
кандидат
Результат
(клеточный
процесс)
Стимул
Молекула-
кандидат
Результат
(клеточный
процесс)

Добрый совет №2
Применяйте комплексные подходы (ингибирование + анализ активации + активация).

Методы in vitro и in vivo
Исследование молекул
Исследование изолированных органелл или их лизатов
Исследование клеток или лизатов клеток
Исследования на органах и организмах

Добрый совет №3
Используйте разные объекты (например, проверяйте результаты на других клеточных линиях)
Для хорошей публикации необходимы исследования на разных уровнях

Методы интегральные или поклеточные
Интегральные методы обычно достовернее (особенно если определяется мол. масса при иммунологических методах) и легче оцифровываются
Поклеточные методы дают информацию о различии клеток в популяции

Преимущество анализа отдельных клеток

Добрый совет №4
Применяйте поклеточные методы в дополнение к интегральными

Обратные связи, ответ «все или ничего» и осцилляции

Добрый совет №5
Исследуйте разные временные точки (динамику ответа).
По возможности применяйте методы, позволяющие наблюдать за живой клеткой

Использование ингибиторных стратегий
Низкомолекулярные ингибиторы (например, киназ или протеаз)
Ингибирующие антитела
DNA decoys (ингибирование ДНК-связывания)
Доминантно-негативные формы (помнить, что именно ингибируется!)
siRNA/shRNA
Нокаутные или условно-нокаутные животные, клетки из них
Нокауты/геномные мутации соматических клеток, включая мутации сайтов промоторов – практически не применяется

Добрый совет №6
Используйте современные специфичные ингибиторы в разумных концентрациях.
Проверяйте неродственным ингибитором или альтернативным подходом.

The selectivity of protein kinase inhibitors: a further update.
Bain J, Plater L, Elliott M, Shpiro N, Hastie CJ, McLauchlan H, Klevernic I, Arthur JS, Alessi DR, Cohen P.
Biochem J. 2007 Dec 15;408(3):297-315.

Введение белков в клетку
Микроинъекция
Пермеабилизация стрептолизином и прочие методы трансфекции белка
Временная (transient) трансфекция ДНК
Постоянная (stable) трансфекция ДНК
«Регулируемая» трансфекция

Добрый совет №7
Помните об артефактах, связанных с уровнем ингибирования или экспрессии.
Помните об ограничениях постоянной и временной трансфекции.

Исследование экспрессии
RT-PCR (в том числе real time)
ИФА или дот-блот
Вестерн-блот
Проточная цитометрия
Иммунофлуоресценция

Добрый совет №8
По возможности пользуйтесь современными высокопроизводительными методами.
Используйте возможности геномики и протеомики, базы данных, массивы кДНК, антител и малых молекул, масс- спектрометрию, многолуночные платы, компьютерную обработку.

Добрый совет №9
Помните, что не все методы достоверны, а антитела, субстраты, ингибиторы специфичны.
Ориентируйтесь на современное мнение ведущих специалистов или проверяйте сами.

Исследование вторичных модификаций (фосфорилирование)
-Фосфоаминокислотный анализ, анализ содержания фосфора, анализ включения радиоактивного фосфора – почти не применяется
-Масс-спектрометрия высокого разрешения
Методы с использованием фосфоспецифических антител
ИФА или дот-блот
Вестерн-блот
Проточная цитометрия
Иммунофлуоресценция
Иммунопреципитация на белок и последующий иммуноблот антителами к фосфоаминокислоте

Исследование локализации
Иммунофлуоресценция
Меченые белки или GFP-fusion
Субклеточное фракционирование

Исследование взаимодействия белков
Образование комплексов in vitro
Колокализация на иммунофлуоресценции (нестрого)
FRET(FREP) меченых белков или GFP-fusion
Ко-иммунопреципитация

Исследование активности фермента (киназы)
-In vitro киназный эссей (радиоактивный или нерадиоактивный)
In gel киназный эссей (зимография)

Исследование транскрипционных факторов
Локализация (Crm1 для shuttling)
EMSA (DNA-binding)
Иммунопреципитация хроматина (ChIP)
FISH
Репортерные конструкции

Добрый совет №10
Используйте адекватные статистические методы

Гланц С. Медико-биологическая статистика.
М.: Практика, - 1998.

Добрый совет №11
Стремитесь к совместной работе (co-laboration)

Добрый совет №12
Международные конференции — незаменимая возможность получить актуальные знания и познакомиться с полезными людьми.

Добрый совет №13
Изучайте науку планировать эксперименты (тактика)
Изучайте искусство планировать направления работы (стратегия)

Удачи!!!

In: Molecular Biology of the Cell
B. Alberts, A. Johnson, J. Lewis,
M. Raff, K. Roberts, P. Walter.
5th edition. 2008
15. Cell Communication + other chapters
Signal Transduction
B. Gomperts, I. Kramer, P. Tatham
2nd edition. 2009