ПЕРВЫЙ ОПЫТ УЧАСТИЯ В ШТРИХ-КОДИРОВАНИИ ВИДОВ РЫБ РОССИИ НА ОСНОВЕ ПЕРВИЧНОЙ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ ГЕНА СО-1

Схема работы:
Отлов
рыб
Запись в
базу данных
Определение
видов
Взятие образцов
скелетных мышц,
Фиксация в спирте
Фотографирование видов рыб
Выделение
ДНК
Амплификация
Электрофорез
Цикло-
секвенирование
Извлечение
дополнительных
последовательностей
из GenBank
Выравнивание
Последовательностей,
Удаление гэпов
Регистрация своих
последовательностей
В GenBank
Построение
филогенетических
деревьев
Редактирование
полученных
последовательностей
Секвенирование

Некоторые из объектов
Рис. 1 Внешний вид (А) полосатой камбалы (Liopseta pinifasciata) и (Б) темной камбалы (Pseudopleuronectes obcurus)
А
Б

Фрагмент таблицы базы данных (в таблице указывается номер пробы (образца), название вида, систематика вида, кем данный вид определен, где собран, кем и когда).

Тотальную ДНК выделяли из скелетных мышц обычной хлороформ-фенольной методикой с осаждением ДНК спиртом.
Полученную ДНК амплифицировали с помощью ПЦР-методики в прямом и обратном направлении с использованием праймеров F1 – R1 и F2 – R2, затем продукты ПЦР подвергали электрофорезу в 1% агарозном геле и окрашивали бромистым этидием после чего просматривали в УФ-свете, где было видно что длина амплифицированной последовательности (т.е. длина гена СО-1) составляет примерно 700п.н. (для определения длины гена использовали маркер (1100+100)).

Праймеры используемые для ПЦР-реакции (Ward et al., 2005)
FishF1-50TCAACCAACCACAAAGACATTGGCAC30,
FishF2-50TCGACTAATCATAAAGATATCGGCAC30,
FishR1-50TAGACTTCTGGGTGGCCAAAGAATCA30,
FishR2-50ACTTCAGGGTGACCGAAGAATCAGAA30.

Вид продуктов ПЦР-реакции в агарозном геле после электрофореза.
Цифрами 2-23 обозначены номера проб, 1 – маркер, стрелкой
обозначен старт электрофореза.
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23

Амплификация
Реакционная смесь на одну пробу (25µl) для ПЦР включала: дистиллированная вода - 17,4 µl; Ex-Tag буфер – 2,5; смесь dNTP – 2,0; праймер F1 (20pmol/ µl ) – 1,0; праймер R1 (20pmol/ µl ) – 1,0; Ex-Tag полимераза – 0,5; образец ДНК – 1,0
30 циклов
Циклосеквенирование
Циклосеквенирование проводили с использованием реагентов фирмы Amersham (Amersham, DYEnamic ET Terminator Cycle Sequencing Kit)
30 циклов

Такой вид имеет последовательность после секвенирования, использовалась модель секвенатора АBI-3100 (Applied Biosistems, USA)

Отредактированная последовательность одного образца.

Окно GenBank

Рис. 8 Окна установления параметров для выравнивания (А) штрафы для первого выравнивания, (Б) штрафы для второго выравнивания
Б
А

Выровненные последовательности гена Со-1 взятые из Генного банка вместе со своими последовательностями

Значения средних р-расстояний по гену Со-1 на четырех различных филогенетических уровнях (средняя+SE) :
1. Внутривидовом 0.09+0.06%
2. Внутриродовом 0.97+1.87%
3. Внутрисемейственном 11.98+0.63%
4. Внутриотрядном 20.09+0.17%

Укорененное дерево построенное на основе метода ближайшего соседства (NJ) показывающее филогенетические взаимосвязи на основе нуклеотидных последовательностей гена Co-1 для 19 проанализированных видов камбал (Pleuronectiformes) и двух внешних таксонов (out-group). В узлах показана bootstrap поддержка n=1000. Древо построено на основе модели Kumara 2 parametres и укорененное по двум внешним таксонам: Окунеообразные (Perciformes). Отрезки снизу показывают масштаб для длин ветвей.

Укорененное Байесовское консенсусное (50%) древо показывающее филогенетические взаимосвязи на основе нуклеотидных последовательностей гена Co-1 для 13 проанализированных видов камбал (Pleuronectiformes) и двух внешних таксонов (out-group). В узлах показаны частоты (вероятности) в n=106 модельных повторностей. Древо построено на основе модели Тамуры-Нея (TrN+I+G) и укорененное по двум внешним таксонам: Окунеообразные, Perciformes. Отрезки снизу показывают масштаб для длин ветвей.

Полученные нуклеотидные последовательности были зарегистрированы в GenBank под номерами:
EF643448 1K-F2 - Liopseta pinifasciata
EF643449 2K-F1 - Liopseta pinifasciata
EF643450 13-R1 - Liopseta pinifasciata
EF643451 5K-F1 - Hippoglossoides dubius
EF643452 7K-F1 - Pseudopleuronectes hersensteini

LOCUS bankit916597 613 bp DNA circular 01-JUN-2007
DEFINITION Flounder mtDNA Co-1 sequence, coding for cytocrome oxidase subunit
1.
ACCESSION 916597
VERSION
KEYWORDS .
SOURCE mitochondrion Pseudopleuronectes hersensteini (Jordan & Snyder,
1901)
ORGANISM Pseudopleuronectes hersensteini (Jordan & Snyder, 1901)
Unclassified.
REFERENCE 1 (bases 1 to 613)
AUTHORS Scharina,S., Kartavtsev,Y., Goto,T., Chichvarkhin,A., Hanzawa,N.,
Sokolovsky,A., Balanov,A., Vinnikov,K. and Ivankov,V.
TITLE BARCODING OF FAR EASTERN FLATFISH SPECIES OF RUSSIA ON CYTOCHROME
OXIDASE 1 AND CYTOCHROME B GENE SEQUENCE DATA
JOURNAL Unpublished
REFERENCE 2 (bases 1 to 613)
AUTHORS Kartavtsev,Y., Scharina,S., Goto,T. and Chichvarkhin,A.
TITLE Direct Submission
JOURNAL Submitted (01-JUN-2007) Group of Genetic Resources, Institute of
Marine Biology, Paltchevski 17, Vladivostok, Primorye 690041,
Russia
COMMENT Bankit Comment: Peter the Great Bay, East Sea, August, 2006
[e-mail].
FEATURES Location/Qualifiers
source 1..613
/organism="Pseudopleuronectes hersensteini (Jordan &
Snyder, 1901)"
/organelle="mitochondrion"
/mol_type="genomic DNA"
/PCR_primers="fwd_name: FishF1, fwd_seq:
tcaaccaaccacaaagacattggcac, rev_name: FishR1, rev_seq:
tagacttctgggtggccaaagaatca"
/genotype="7K-F1"
/note="Pisces, Pleuronectiformes, Pleuronectidae,
Pseudopleuronectes hersensteini"
gene 11..613
/gene="CO-1"
CDS 11..613
/gene="CO-1"
/codon_start=1
/transl_table=2
/protein_id="PROT_1_bankit916597"
/translation="MSLGTGLSLLIRAELSQPGALLGDDQIYNVIVTAHAFVMISL**
YQLWLEGSETDYPLMIGAPEYGLPSNKNMSFWLLPPSFLLLLASSGWSRGGN*WTVTP
H*LELAHAGAS*THHFSLHLAGISQF*GQSTLSPHMNETNSSTMYQIPYLFGPYNYRC
PSSPFPPVLAAGITCYWQTAT*TQPSLTLR*GWPILYLLG"
BASE COUNT 147 a 172 c 124 g 170 t
ORIGIN
1 tgttgtttgt gtgagcctgg ggacaggcct aagtctgctc attcgagcag agctaagcca
61 acctggggct ctcctgggag acgaccaaat ttataacgta atcgtcaccg cacacgcctt
121 tgtaataatt tctttatagt aataccaatt atgattggag ggttcggaaa ctgactatcc
181 attaataatt ggggcccccg aatatggcct tccctcgaat aaaaacatga gcttctgact
241 tctaccccca tccttcctcc ttcttttggc ctcttcaggg tgaagccggg gcgggaacag
301 gtgaaccgtt accccccact agctggaact agcacacgcc ggagcatcgt agactcacca
361 tttctctctt caccttgccg gaatttctca attctagggg caatcaactt tatcaccaca
421 tataaatgaa accaacagca gtactatgta ccaaatcccc tatttgtttg ggccgtataa
481 ttaccgctgt ccttcttctc ctttccctcc ggttctagcc gctggcatta catgctactg
541 acagaccgca acctaaacac aaccttcttt gaccctgcgg agggggtgac ccattcttta
601 cctgttgggt taa
//
Так выглядит запись одной из последовательностей в GenBank:

СПАСИБО ЗА ВНИМАНИЕ!