РНК-интерференция Выделение и очистка нуклеиновых кислот

Некодирующие РНК:
Типы некодирующих ДНК:
Некодирующая функциональная РНК (рибосомальная РНК, транспортная РНК, Piwi-РНК – 26-31, microRNA – 21-24).
Цис- и транс-регуляторные элементы
Интроны
Псевдогены
Повторые последовательности, транспозоны и вирусные элементы
Теломеры
Функции:
- Регуляция экспрессии генов, Защита генома, генетические переключатели, факторы транскрипции, операторы, энхансеры, инсуляторы

МикроРНК
МикроРНК - MicroRNAs (miRNAs) – 21-24 нуклеотидов
Они вызывают деградацию РНК или блокируют ее трансляцию

Феномен ингибирования экспрессии генов молекулами РНК называется РНК-интерференцией (RNAi technology)
РНК-интерференция вызывается «small interfering RNAs (siRNAs)» – малыми интерферирующими РНК (иРНК или миРНК) – они же – еще одно название - микроРНК, это историческое название. Обычно в среднем 21-22 нуклеотида.
У животных – часто прикрепляется в начале мРНК, одна микроРНК для нескольких десятков генов. У растений – в большинстве случаев требуется точнейшее «попадание» – если отличие в один или несколько нуклеотидов, то будет отсутствовать трансляция.
Фермент, распознающий и «уничтожающий» бессмысленную конструкцию - дайсер.

МикроРНК, препятсвующие синтезу белка «А» можно вводить в плазмиду, которая может содержаеть ген, кодирующих ЗФБ.
Тогда становится, видно, где белок «А» точно не образуется.
(зеленый цвет на фотографии)

Gene silencing mechanisms:
http://www.youtube.com/watch?v=D-77BvIOLd0

Изоляция и визуализация
нуклеиновых кислот (НК)
Зачем изолировать нуклеиновые кислоты?
Источники НК
Технические аспекты и ограничения
при изоляции и очистке НК
 Ключевые стадии изоляции и очистки НК
Визуализация НК (гель-электрофорез в
агарозе, полиакриламидные гели: PAGE)

Нуклеиновые кислоты: сырой
материал для генных технологий
 ДНК:
хромосомная ДНК
плазмидная ДНК
вирусная ДНК
(двух- и одноцепочная ДНК)
 РНК – основные классы:
рибосомальная РНК (рРНК)
матричная РНК (мРНК)
транспортная РНК (тРНК)

Для чего нужна изоляция НК?
Клонирование ДНК
ПЦР и изучение уровня экспрессии специфических генов
Секвенирование ДНК
ДНК-фингерпринтинг и картирование
ДНК-гибридизация
ДНК-мутагенез
Клонирование экспрессируемых генов - cloning of expressed genes - cDNA cloning. Комплиментарной ДНК - это ДНК, синтезированная из зрелой мРНК в реакции, катализируемой обратной транскриптазой. В ней, как правило, удалены интроны.
Анализ экспрессии РНК (Northerns) – Нозерн-блоттинг
мРНК амплификация – для синтеза белков in vitro (первый шаг при биохимическом изучении белка in vitro)

Нозерн-блот - метод исследования экспрессии генов путём тестирования молекул РНК (мРНК) и их фрагментов в образцах.
Гибридизация с ДНК-зондом указывает на экспрессию определенного гена.

ДНК/РНК -зонд (англ. DNA/RNA probe или hybridisation probe) - фрагмент ДНК или РНК, меченный флуоресцентным, радиокативным или каким-то другим маркером и использующийся для гибридизации со специфическим участком молекулы ДНК/РНК.
Позволяет идентифицировать комплементарные ему нуклеотидные последовательности.
Процессы гибридизации происходят между любыми одинарными цепями, если они комплементарны: ДНК–ДНК, РНК–РНК, ДНК–РНК.
ДНК при температуре 94–100оС диссоциирует на 2 цепи, так как водородные связи между основаниями разрушаются. Этот процесс обратим: при температуре 65-70оС происходит восстановление структуры двойной спирали. Зонд добавляется при повышенной температуре и просоединяется с одноцепочной ДНК.

На основе гибридизации осуществляют анализ с помощью ДНК-чипов: аналитические (детектирующие) ДНК-зонды гибридизуются со специфическими последовательностями нуклеиновых кислот и, таким образом, выявляют их в исследуемых образцах.
Флуоресцентно-меченые зонды используются для проведения ПЦР в реальном времени, позволяющей детектировать количество ДНК в исследуемом образце.
Также флуоресцентные зонды используются при проведении флуоресцентной гибридизации in situ (FISH — Fluorescence in situ hybridization) — цитогенетического метода, который применяют для детекции и определения положения специфической последовательности ДНК на интактных («жизнеспособных») хромосомах.
В нанотехнологии ДНК-зонды используются при создании детектирующих систем нового поколения (ДНК-наночипы).

Ключевые требования к изоляции НК:
 Количество:
достаточное количество для ваших целей:
ПЦР – малое количество (нг)
Клонирование – среднее количество (μг)
Генная терапия – гигантские количества (мг)
 Качество:
отсутствие склеивания (ширинга) и разрывов
отсутствие суперспирализации плазмидной ДНК
 Чистота:
свободно от загрязнителей:
нуклеаз (ДНКаз, РНКаз)
белков
ингибиторов (гуминовая кислота и др.)
фенольных соединений (схожие спектр. сво-ва)

Ключевые стадии изоляции НК:
 Лизирование (разрушение) клеток
 Депротеинизация (устранение белков)
 Очистка
 Концентрирование (осаждение)

Белок
ДНК и РНК
Лизирование клеток:
Механическое/звуковое:
встряхивание со стеклянными шариками,
французский пресс (через сито)
замораживание/оттивание
перетирание (например, в пудру в жидком азоте)
озвучивание (баззер – ультразвуковой дезинтегратор)
Ферментативное: лизоцим, целлюлазы и т.д.
Химическое: SDS (sodium dodecyl sulfate)/NaOH
CTAB
Гуанидиум изотиоцианат
Далее центрифугирование
(удаление осадка – дебриса):
Киты:
www.promega.com
Клеточный
дебрис

Изоляция плазмидной ДНК

Сырой
лизат
добавление
смеси фенол/
хлороформ
или просто
хлороформа
Ультраскоростное
перемешивание
(Vortex-мешалка)
центрифугирование
Депротеинизация (удаление белка)
декантирование
устранение
белок
ДНК и РНК

Центрифугирование в градиенте плотности EtBr/CsCl
Разделение ДНК на основе ее конформации
Очистка нуклеиновых кислот
Макромолекулы в CsCl-градиенте формируют
полосы в определенных зонах градиента в зависимости
от их плотности («плавучей» плотности - buoyant density)
ДНК ~ 1.7 г/cм3
Белки имеют более низкую плотность
РНК имеет более высокую плотность

центрифу-
гирование
50,000 x g
в течение
ночи
линейная &
ocДНК (открытая
кольцевая)
плазмидная ДНК
ДНК
РНК
 Добавление этидиум-бромида (EtBr) используется для того, чтобы отобрать вирусную cccДНК (covalently closed circular DNA) и oc/линйеную ДНК
EtBr встраивается между соседними парами оснований ? вызывает частино расплетание спирали ? это снижает плотность ДНКcccДНК имеет очень ограниченные возможности к расплетанию ? соответственно, в присутствии EtBr ее плотность снижается меньше, чем у других форм ДНК и РНК
возрастающая
концентрация
CsCl при
центрифуги-ровании

Очистка с использованием колонок
 Очистка на основе EtBr/CsCl является медленной и дорогой
В последнее время развились системы колоночной очистки. Они основаны на силиконовом/силикагелевом (кремниевом) наполнителе.
- В колонку вносят сырой экстракт ДНК, полученный при высокой концентрации солей. Он закрепляяется в колонке, которыую промывают устраняя белки и другую органику. Затем промывают раствором, открепляющим НК от оксида кремния.
Это наиболее часто используемый метод в молекулярной биологии и биотехнологии:
- быстрый и дает высокое качество ДНК
- надежный, простой и быстрый
- процедуры могут быть роботизированы
 компании-производители колонок: Qiagen and Promega

НК связываются с твердой фазой (оксид кремния или другой наполнитель-сорбент) по-разному в зависимости от pH и содержания солей в буффере, которым может быть Трис-ЭДТА или фосфатный буффер (чаще используется при подготовки для ДНК-микроэррэй - DNA microarray, в связи с тем, что в Трисе содержатс\я реакционно-активные аминогруммы)

Типичные стадии протокола:
Образец помещается в колонку вместе со «связывающим раствором», который способствует тому, что НК связываются к сорбенту (кремнию) – в этом растворе низкое рН (при низком рН силаноловые группы кремния активны), добавлены ионы натрия и часто белок-денатурирующий агент – часто это гуанидин гидрохлорид (GdmCl), сильнейший детергент Triton X-100, изопропанол и pH-индикатор.
Колонка промывается раствором с высоким рН и низким содержанием соли (5 мM KPO4, pH 8.0 или выше). НК отделяются от стенок и собираются в пробирку.
Промывается 80-процентным спиртом для очистки. Может быть использована несколько раз.

Простой, быстрой и при этом недорогой протокол на основе колонок Qiagen

Роботизация процесса выделения НК

Концентрирование НК
Требуется для формирования больших количеств
ДНК или РНК (μг):
 Обычно достигается осаждением порций НК при помощи:
смеси изопропанола (+/-) с ацетатом аммония
или
этанол /ацетат натрия (pH 4.8/5.2)
затем вымывание 70% EtOH (этанолом)

Гель-электрофорез
 Это разделение молекул на основе относительной миграции через гель в электрическом поле:
 ДНК заряжена отрицательно и мигрирует от катода к аноду через гелевый матрикс.
Два основных типа гель-электрофореза:
1. Гель-электрофорез в агарозе
- обычно используется при разделении молекул НК размером от 100 kб to 100 бп
- два варианта:
* пульс-гель электрофорез (PFGE) &
** гель электрофорез в инвертированном поле (FIGE) - используется при разделении больших молекул (50-1000 kб)
2. Полиакриламидный гель-электрофорез (PAGE)
- разрешение одиночных пар нуклеотидов

- (cathode)
+ (anode)
0.3
0.5
3.0
2.0
1.0
Гель-электрофорез в агарозе
HindIII
λ DNA
A
B
C
D
E