Полимеразная цепная реакция — ПЦР

Что такое ПЦР?
Методика для «усиления» (получения многочисленных копий) специфического участка двухцепочной ДНК.
В ходе ПЦР-реакции образуются в больших количествах два амплимера – участка ДНК, заданного гена.
При расплавлении ДНК два праймера прикрепляются к комплиментарным участкам темплейта. Термостабильная ДНК-полимераза из Thermus aquaticus (Taq-полимераза)
синтезирует комплиментарные участки амплимера, начиная от праймера.
Каждый цикл включает нагрев для денатурации ДНК и частичного охлаждение для возможности прикрепления праймеров к темплейту, с которого снимается копия.
При частичном охлаждении также Taq-полимераза синтезирует копию гена или его заданного участка. Каждый цикл удваивает количество ДНК до цикла.

Компоненты ПЦР
 ДНК-темплейт, например, грубый клеточный экстракт, общая геномная ДНК, плазмидная ДНК и т.д. (нанограммы)
 Два олигонуклеотидных праймера
обычно 20 нуклеотидов (20-mer), (бывает 18-30!)
(д.б. Одинаковой температуры плавления Tm of ~ 60°C)
 dNTPs – деоксинуклеозид-трифосфаты
(dATФ, dЦTФ, dГTФ, dTTФ)
 ДНК-полимераза (и буффер)
обычно Taq-ДНК-полимераза
 ПЦР-буффер, обычно с Mg2+

? Историческая перспектива I
метод был предложен в 1983 группой, работающей в Корпорации Cetus.
Кэри Муллиз считается разработчиком (лауреат Нобелевской премии по химии 1993 года).
Впервые опубликовано:
 Saiki et al., (1985) Enzymatic amplification
of beta globin genomic sequences and
restriction site analysis for diagnosis of
sickle cell anemia. Science 230: 1350-1354.
В начале проводилась в ванночках с горячим раствором разной температуры – сейчас это делают ПЦР-машины
Фермент: Фрагмент Кленова ДНК-полимеразы E. Coli. Была необходимость добавления свежего фермента после каждого цикла денатурации
Кэри Муллиз

 Изоляция Taq-ДНК-полимеразы
Источник: Thermus aquaticus
Ключевое свойство: термостабильность
Применение Taq в ПЦР было впервые описано:
 Saiki R. K et al., (1988) Primer-directed enzymatic amplification of DNA with a thermostable DNA polymerase.
Science, 1988 239:487-91.
Эта находка революционизировала ПЦР, сейчас это основной фермент в большинстве приложений на основе ПЦР
? Историческая перспектива II

Технические аспекты ПЦР
❶ Дизайн праймеров
❷ Температура ренатурации (отжига)
❸ Предотвращение загрязнения
❹ Число ПЦР-циклов
❺ Концентрации Mg2+
❻ Выбор полимеразы

❶ Дизайн праймеров
сбаллансированная точка плавления Tm для обоих праймеров.
Tm = (A+T) x 2 + (G + C) x 4
высокая консервативность 3’-конца – существенный фактор
желателен участок, обогащенный Г или Ц на 5’-конце; это повышает стабильность
избегание комплиментарности между праймерами, что снижает образование димеров из двух праймеров
избегание последовательных повторов Г и Ц, что снижает вероятность образования гарпинов
 NCBI primerBLAST – одна из лучших программ для дизайна праймеров

❷ Температура ренатурации (отжига)
обычно на 5 градусов ниже температуры плавления данных праймеров (5°C)
Более высокая температура ренатурации
? Более высокая «stringency» – аккуратность связывания (выше требуемая комплиментарность)
Более низкая темпаратура ренатурации -
? Более низкая «stringency»

❸ Предотвращение загрязнения
Контроль реагентов
- используется только стерильная деионизованная или дистиллированная вода
стерильная пластиковая посуда и непросроченные реагенты
дозаторы (автоматические пипетки), которые используются для ПЦР больше нигде не используются в лаборатории
отдельная ПЦР-кабинеты

❹ Число ПЦР-циклов
С увеличением кол-ва ПЦР-циклов
☺ + растет кол-во (“урожай”) ДНК
☹ - растут ошибки в последовательности НК
☹ - если используется смесь темплейтов, то увеличивается вероятность образования химер (при смешении последовательностей двух темплейтов)

❺ Концентрация Mg2+
увеличение [Mg2+] приводит к:
? повышению стрингетности
(четкости гибридизации)
? снижению кол-ва синтезируемых НК
(вследствие частичной инактивации полимераз
под действием Mg2+)
рекомендуемая концентрация:
1.5-3 мM MgCl2

❻ Выбор полимеразы
 Taq-полимеразы :
Преимущества:
☺ Высокий «урожай» (выход НК)
☺ Taq-полимераза добавляет A (аденозин) на обоих концах синтезируемой НК, что облегчает клонирование в так-называемых TA-векторах
Недостатки:
☹ Высокая степень ошибок, отсутствие так-называемого пруфридинга (проверки, редакции) синтезируемой НК
 Альтернативные полимеразные системы:
Все обладают пруфридингом (proof-reading): 3´ - 5´-экзонуклеазной активностью
Pwo (Pyrococcus woesei),
Vent (Thermococcus litoralis)
Pfu (Pyrococcus furiousus)
☺ высокий уровень точности (совпадения)
? образуютя продукты с тупыми концами Blunt-ended products
☹ низная производительность
Наиболее часто исследователи используют комбинации ферментов:
например «Expand» (смесь Taq и Pwo)

TA-клонирование ПЦР-продуктов
- главное преимущество это простота и дешевизна, так как требуется всего одна рестристаза и небольшой набор других ферментов и методических этапов:

Сокращения для нуклеиновых оснований:
A — А: Аденин;
G — Г: Гуанин;
C — Ц: Цитозин;
T — Т: Тимин (5-метилурацил), только в ДНК;
U — У: Урацил, только в РНК.
Повторение: «химия» нуклеиновых оснований:

Вариации на тему ПЦР: производные протоколы
❶ ПЦР из РНК – при помощи обратной транскриптазы
❷ Клонирование ПЦР-продуктов
❸ «Циклическое» ПЦР-секвенирование
❹ ПЦР-фингерпринтинг и создание генетических карт
❺ Оптимизированное ПЦР:
Hot-start ПЦР
Nested ПЦР
Touchdown ПЦР
Long ПЦР
❻ Детекция множественных генов – мультиплексая ПЦР
❼ Количественная и конкурентная ПЦР
❽ Локализация сайтов экспрессии генов – ПЦР in situ

ПЦР при помощи обратной транскриптазы (RT-PCR)
5’
AAAAAAA 3’ мРНК
TTTTTTT 5’
Primer
AAAAAAA 3’ мРНК
TTTTTTT 5’ кДНК
5’
3’
TGCTAT
3’
5’
Синтез первой
цепочки
? кДНК (копия)
TTTTTTT 5’
3’
? ?
TTTTTTT 5’
3’
ПЦР
Обратная транскриптаза
Taq-ДНК-полимераза
3’
??
AAAAAAA 3’
TGCTAT
5’
dsDNA
Циклы обычной ПЦР

Области применения:
Позволяет получить подтверждение того, что определенный ген экспрессируется, при том даже если экспрессия очень низка
Может быть использована для подсчета экспрессии генов во времени в зависимости от различных действующих факторов и условий (например, атака патогенов, засоление или активация определенных программ развития – цветение, закладка семян, биосинтез фенольных производных, морфогенез и т.д.)
Сравнение уровня экспресси гена по отношению к контролю (при генетических манипуляциях)
Недостатки:
Может быть использована только для известных генов
Необходимость высокой специфичности праймеров
Проблема контроля – экспрессия всех генов изменяется во времени, даже контрольных
RT- PCR (reverse transcriptase PCR)

Оптимизация ПЦР
 Hot-start ПЦР (горячий старт)
Реакция удерживается на «ДНК-денатурирующей температуре до добавления ферментов и нуклеотидов:
- предотвращает формирование димеров праймеров
- снижает уровень миспрайминга (неправильного присоединения праймеров)
 Chou et al., 1992 Nucl. Acids Res. 20, 1717-1723.
 Nested ПЦР (гнездовой ПЦР)
первое применение – ДНК β-глобулина – сначала усиление большого участка, потом более короткого (2 набора праймеров)
Mullis & Faloona, 1987 Meth. Enzymol. 155,335-350.
 Ступенчатая ПЦР (Touchdown PCR) – для уменьшения влияния неспецифического связывания праймеров. Первые циклы проводят при температуре выше оптимальной температуры отжига, затем каждые несколько циклов температуру отжига постепенно снижают до оптимальной. Это делается для того, чтобы праймер гибридизовался с комплементарной цепью всей своей длиной; тогда как при оптимальной температуре отжига, праймер частично гибридизуется с комплементарной цепью. Частичная гибридизация праймера на геномной ДНК приводит к неспецифической амплификации, если участков связывания для праймера достаточно много. В большинстве случаев, первые десять ПЦР циклов, можно проводить при температуре отжига в 72-75°С, а затем сразу снизить до оптимальной, например до 60-65°С.  Don et al., 1991 Nucl. Acids. Res. 19, 4008.

Оптимизирование ПЦР
 Long PCR (продолжительная ПЦР)
Taq-ДНК-полимераза обычно ограничена синтезом 5000 оснований
поэтому ее комбинируют с другим ферментом, например, Expand, Pfu, который может амплифицировать до 30000-40000 оснований
 Cheng et al., 1994 PNAS (USA) 91, 5695-5699.
Вторая полимераза используется для корректировки ошибок Taq-полимеразы, которая останавливает синтез ДНК в случае добавления некомплементарного нуклеотида (его удаляет вторая полимераза).
Смесь полимераз: 50:1 или 100:1, т.е. Taq-полимеразы в 25-100 раз больше по отношению к Pfu-полимеразе.

Детекция множественных генов: Multiplex PCR
 Chamberlain et al., (1988) Nucl. Acids Res. 16,11141-11156

Количественный анализ НК при помощи ПЦР
Многочисленные «неточности» делают процесс количественного ПЦР-анализа проблематичным
3 подхода:
a) конкурентная ПЦР: с использованием контрольной ДНК известной концентрации в качестве внутреннего стандарта.
б) саузерн-блот + ДНК-зонд (гибридизационная проба)
в) Real Time (с флуоресцентной детекцией) – наиболее широко используемый сейчас метод.
 Смотрите доп. информ.: Applied Biosystem’s Real time PCR page

ПЦР in situ
ПЦР внутри клетки
обычно это фиксированный на предметной стекле клеточный экстракт

Количественный ПЦР – анализ данных
В основе лежит флуоресценция, возрастающая по ходу ПЦР-эксперимента:
С использованием флуоресцентного красителя SYBR green, который флуоресцирует ярче только в присутствии ds-ДНК. SYBR green может быть просто добавлен в реакционную смесь ПЦР-реакции, а его возрастающая флуоресценция будет свидетельствовать о росте концентрации ампликона.
Главный недостаток: если праймеры образуют димеры в большой концентрации, то результаты являются артефактом.

Use of Taqman probes relies on a third primer (called the probe) labelled at the 5’ end with a fluorescent molecule and a quencher (inhibitor of fluorescence at the 3’end). During PCR the probe is degraded by Taq polymerase and the fluor is separated from its quencher and an increase in fluorescence is detected
Quantitative real time PCR – more details -2

Любой из методов даст экспоненциальные кривые роста интенсивности флуоресценции
Ct

Можно перевести интенсивность флуоресценции в логарифмический масштаб, что облегчает дальнейший анализ

Методы нормализации
Обычно это нормализация ампликона ДНК или мРНК относительно гена-стандарта
Например, когда требуется подсчитать мРНК (как кДНК-продукт), используются гены актина или тубулина, которые имеют высокую экспрессию в независимости от условий.
Отсутствуют идеальные гены-стандарты и желательно использовать дополнительные методы детекции (например, нозерн-блот), чтобы показать, что экспрессия гена-стандарта не изменяется в ходе эксперимента.
Относительный уровень = уровень мРНК в тесте
(отношение ) уровень мРНК в контроле

Уровни ДНК и РНК тестируемого гена могут быть вычислены относительно двух различных условий (например, в контроле и при стрессе) или относительно гена-стандарта.
X = 2 ΔCt (target control – target test)

The final test versus control level of a DNA or mRNA molecule normalised for a reference gene can be put together as a ratio…………………
2 ΔCt (target control – target test)
2 ΔCt (actin control – actin test)
X
Xc
=
(see Pfaffl 2001)

AFTER N CYCLES:
fold increase = (efficiency)n
CYCLE
AMOUNT OF DNA
AMOUNT OF DNA
100% EFFICIENCY
70% EFFICIENCY
0
1
1
1
2
2
2
4
3
3
8
5
4
16
8
5
32
14
6
64
24
7
128
41
8
256
70
9
512
119
10
1,024
202
11
2,048
343
12
4,096
583
13
8,192
990
14
16,384
1,684
15
32,768
2,862
16
65,536
4,866
17
131,072
8,272
18
262,144
14,063
19
524,288
23,907
20
1,048,576
40,642
21
2,097,152
69,092
22
4,194,304
117,456
23
8,388,608
199,676
24
16,777,216
339,449
25
33,554,432
577,063
26
67,108,864
981,007
27
134,217,728
1,667,711
28
268,435,456
2,835,109
29
536,870,912
4,819,686
30
1,073,741,824
8,193,466
AMOUNT OF DNA

Cycle efficiency (E) for a primer pair can be calculated from the log of the slope and this can be included in calculations……………………………(see Ramakers et al 2003)
All of this can now be automated and roboticised such that many genes can be assayed at once.
For example, the expression of 1400 transcription factor genes have been assayed simultaneously in Arabidopsis (model plant species) see Czechowski et al 2004