С.А. Попов зав. лабораторией микробиологии НИИ фтизиопульмонологии Первый МГМУ им. И.М.СеченоваМосква, 12-05-2011

Туберкулез, г. Москва
в/выявленные, всего
в/выявленные, МБ+
активные ТБ, всего
активные ТБ, МБ+
Основные эпидемиологические показатели, абс. значения
Попов СА НИИ фтизиопульмонологии
Первый МГМУ ИМ Сеченова, Москва, 2011

Объемные показатели
исследований, г. Москва, 2009 г.
Посевов диагностических – 40 тыс.
Посевов для контроля лечения – 62 тыс.
Посевов ускоренной диагностики – 28 тыс.
Выявляется культур МБ – 8,3 тыс.
нуждаются в первичной
идентификации – 8,3 тыс.
нуждаются в видовой
дифференциации 8,3 тыс.
Попов СА НИИ фтизиопульмонологии
Первый МГМУ ИМ Сеченова, Москва, 2011

Этапы идентификации
микобактерий туберкулеза
Первичная идентификация (культуральные характеристики)
длительность роста на средах;
пигментообразование;
морфология колоний;
наличие кислотоустойчивой окраски;
температура роста.
Попов СА НИИ фтизиопульмонологии
Первый МГМУ ИМ Сеченова, Москва, 2011

Этапы идентификации
микобактерий туберкулеза
Дифференциация МБТ от НТМБ
(биохимические и рост на селективных средах)
способность продуцировать никотиновую кислоту (ниациновый тест);
наличие нитратредуктазы;
наличие термостабильной каталазы;
рост на среде с натрием салициловокислым;
рост на среде с пара-нитробензойной кислотой;
рост на среде с хлоридом натрия.
Исключения: M.simae, M.gastri, M.marinum, M.terrae
Попов СА НИИ фтизиопульмонологии Первый МГМУ ИМ Сеченова, Москва, 2011

Колонии микобактерий на среде Левенштейна-Йенсена

Систематическое положение микобактерий и проблемы идентификации МБТ
На 2008 г описано более 120 видов микобактерий, из них 7 относятся к комплексу видов M.tuberculosis
Порядок Actinomycetales
Семейство Mycobacteriaceae
Род Mycobacterium
Основные проблемы идентификации МБТ:
Классические методы – длительность (30 дн.)
Молекулярно генетические – трудозатратность (3-4 дн.)
Иммунологические – низкая специфичность (<75-80%)
Попов СА НИИ фтизиопульмонологии
Первый МГМУ ИМ Сеченова, Москва, 2011

Клинические аспекты идентификации
Идентификация микобактерий туберкулеза (28 дней)
сдерживает передачу результатов ускоренных методов диагностики лекарственной устойчивости МБТ
Бактек-960 общей производительностью
8 тыс. иссл./год
Средняя длительность тестов на ЛЧ 7-9 дней
Попов СА НИИ фтизиопульмонологии Первый МГМУ ИМ Сеченова, Москва, 2011

Фундаментальные исследования МБТ
Из 33 специфических белков, отличается тем, что секретируется во внешнюю среду, являясь индикатором роста М.tuberculosis.
Белок MPT64 - предоминантный белок,
массой 24 kDa, обладает иммуногенным свойством.
Предложен как потенциальный кандидат состава вакцины,
(распознается T-лимфоцитами CD4+).
позволили выявить видоспеци-фичный белок
AgMPT64
Карта генома М.tuberculosis H37Rv, Nature, 1998
Попов СА НИИ фтизиопульмонологии Первый МГМУ ИМ Сеченова, Москва, 2011

Микро-ммунохроматографический тест
Конъюгат: конъюгат коллоидного золота и мышиных моноклональных антител к МРТ64 (0,24±0,048 мкг);
Тестовая полоса (Т): мышиные моноклональные антитела к МРТ64 (0,32±0,064 мкг)
Контрольная полоса (С) : антитела козы к иммуноглобулинам G мыши (0,64±0,128 мкг)
Попов СА НИИ фтизиопульмонологии Первый МГМУ ИМ Сеченова, Москва, 2011

Процедура проведения теста
Р
Е
З
У
Л
Ь
Т
А
Т
Колония с плотной среды
100 мкл буфера
Перемешать
Конденсат с среды (Агар)
100 мкл буфера
Жидкая среда
100 мкл взвеси жидкой среды
МБТ
НТМБ
Попов СА НИИ фтизиопульмонологии
Первый МГМУ ИМ Сеченова, Москва, 2011

Список проверенных видов НТМБ
Попов СА НИИ фтизиопульмонологии
Первый МГМУ ИМ Сеченова, Москва, 2011

Бактерии
68 видов 137 штаммов
Грибы
8 видов 15 штаммов
Нетуберкулезные МБ
40 видов 57 штаммов
51 клин. культур
Список проверенных
видов микроорганизмов
Попов СА НИИ фтизиопульмонологии Первый МГМУ ИМ Сеченова, Москва, 2011

Аналитическая чувствительность теста SD MPT64
штаммы МБТ и M.bovis в различных разведениях относительно Ст.мутн.№5
(5*108 микр. тел)
Результат реакции – интенсивность окраски в баллах от 1+ до 3+
= 1*105 КОЕ/мл, при снятии с плотной питательной среды ЛЙ
Попов СА НИИ фтизиопульмонологии Первый МГМУ ИМ Сеченова, Москва, 2011

Аналитическая чувствительность
теста SD MPT64
штаммы МБТ и BCG с разной длительностью культивирования после
индикации роста в системе Бактек-960 в баллах окраски
5*106 микр. тел/мл, жидкая питательная среда MGIT,
Попов СА НИИ фтизиопульмонологии Первый МГМУ ИМ Сеченова, Москва, 2011

Диагностическая чувствительность теста,
чистая культура МБТ, плотные п/среды
Попов СА НИИ фтизиопульмонологии Первый МГМУ ИМ Сеченова, Москва, 2011

Диагностическая специфичность метода,
чистые культур НТМБ, плотные п/среды
1,2M.avium, 1,2M.kansasii, 1M.flei, 1M.scrofulaceum, 1,2M.fortuitum, 1M.simae, 1,2M.intracellularae,
Попов СА НИИ фтизиопульмонологии Первый МГМУ ИМ Сеченова, Москва, 2011

Диагностическая чувствительность метода,
культуры МБТ, среда MGIT Бактек-960
* Недостаточное время дополнительного культивирования
Попов СА НИИ фтизиопульмонологии Первый МГМУ ИМ Сеченова, Москва, 2011

Диагностическая специфичность метода,
культуры НТМБ, среда MGIT Бактек-960
1,2M.avium, 1,2M.kansasii, 1M.flei, 1M.scrofulaceum, 1,2M.fortuitum, 1M.simae, 1,2M.intracellularae,
Попов СА НИИ фтизиопульмонологии Первый МГМУ ИМ Сеченова, Москва, 2011

Диагностика МБТ в различных материалах
Попов СА НИИ фтизиопульмонологии Первый МГМУ ИМ Сеченова, Москва, 2011

Экспресс-идентификация культур МБТ:
микроиммунохроматография vs PNB/NaS/ПЦР
Косы МБТ, ZNх400
МБ - ?, ZNх1000, жидкая питательная среда
Попов СА НИИ фтизиопульмонологии Первый МГМУ ИМ Сеченова, Москва, 2011

Рекомендации по дифференциации видов МБТ/НТМБ
мокрота
мокрота
Культура МБ
Культура МБ
«На глаз» /ПЦР/ культуральный тест
Алгоритм определения комплекса видов МБТ
МБТ
НТМБ
МБТ
НТМБ
Доступно
Точно
Быстро
Попов СА НИИ фтизиопульмонологии Первый МГМУ ИМ Сеченова, Москва, 2011

Что это дает…?
Снижение лабораторной нагрузки:
Времязатраты на каждый тест снижается с 40 мин. лаб. времени до 3-5 мин.
Сокращение длительности идентификации с 28 дней до 10 (!) мин.
Реализация преимуществ ускоренных автоматизированных методов
(Бактек-технологии)
Попов СА НИИ фтизиопульмонологии Первый МГМУ ИМ Сеченова, Москва, 2011