Снижение электрической прочности и электрический пробой мембран

Электрический пробой плоских фосфолипидных мембран (БЛМ)

Приготовление БЛМ
А
В
Г
1
5
4
3
2
Б

Установка для получсения БЛМ и измерения ее электрических свойств

БЛМ как объект изучения ионной проницаемости липидного слоя мембран

Зависимость времени жизни липидных пор от напряжения
ϕ (V)
6
4
2
0,2
0,4
0,6
ФХ + лизоФХ
ФЭ
ФХ
Lg τ мс
Точки – эксперимент
Линии - теория

Пробой БЛМ при действии постоянного электрического поля

BLM as a tool to measure membrane ionic permeability
HCl
U
I
emp
Ri
Ru
emp - electro motive force.
The potential difference
applied to our system from
an external source.
U - membrane potential.
I - membrane current.
Electrode
Electrolyte
Bilayer lipid membrane (BLM)
Voltmeter
Ampermeter

Измерение потенциала на мембране (слева) и тока через мембрану (справа)
Ro – нагрузочное сопротивление , Ri – внутреннее сопротивление милливольтметра, Rm – сопротивление БЛМ. При снижении Rm ток через мембрану и потенциал на мембране уменьшаются.
ϕm
im

Вольт-амперные характеристики БЛМ

“Динамический” метод измерения потенциала пробоя БЛМ
Время, с
0
30
60
90
120
200
150
100
50
0
U
(mV)
Выкл
Выкл
Вкл
Вкл
U
*
Потенциал пробоя
Стресс

Электрический пробой БЛМ
P
УФ
Фосфо-липаза A2
пептид
СГД
0
20
10
0
20
10
0
20
10
0
20
10
Время, мин
U*
30
60
90
Потенциал пробоя БЛМ, мВ
СГД

Влияние изменения гидростатического давления на потенциал пробоя БЛМ

Влияние пробоя на электрическую прочность БЛМ
Смирнов,А.А.; Путвинский,А.В.; Рощупкин,Д.И.; Владимиров,Ю.А. Необратимое повреждение липидных бислойных мембран в состоянии электрического пробоя. Биофизика 25: 140-142 (1980).
1 – Контроль
2 – 1 + пробой
3 – 2 + Са2+
4 – 1 + УФ

Пробой мембран собственным (ионным диффузионным) потенциалом

Концентрационный потенциал, образуемый на БЛМ в присутствии ионофора
Потенциал Нернста
Электролит + ионофор
БЛМ

Самопробой БЛМ при высоком ионном диффузионном потенциале

Самопробойц БЛМ

Электрический пробой мембран собственным мембранным потенциалом

Кинетическая кривая изменения протонного диффузионного потенциала при УФ-облучении БЛМ
Путвинский,А.В.; Пучкова,Т.В. Протонная проницаемость и электрический пробой фосфолипидных мембран после УФ-облучения. Биофизика 26 (3): 481-486 (1981)

HCl
УФ
40
2
10
20
30
0
6
4
7.5
8.0
Потенциал пробоя
Время, мин
Самопробой БЛМ при УФ облучении
Разность потенциалов, мВ

Пробой БЛМ при УФ облучении
Путвинский,А.В.; Пучкова,Т.В. Протонная проницаемость и электрический пробой фосфолипидных мембран после УФ-облучения. Биофизика 26 (3): 481-486 (1981)
Рис. 1. Изменение сопротивления БЛМ (R), приготовленных из митохондриальных липидов (а) и яичного лецитина (б). Потенциал на мембранах до облучения 28 мВ. Стрелка показывает начало Уф-облучения

Electrical breakdown of BLM under UV

Потенциал пробоя БЛМ (Uпр), приготовленных из ми-тохондриальных липидов (а) и яичного лецитина (б)
Путвинский,А.В.; Пучкова,Т.В. Протонная проницаемость и электрический пробой фосфолипидных мембран после УФ-облучения. Биофизика 26 (3): 481-486 (1981)

Пробой БЛМ при разном диффузионном потенциале

Электрический пробой фосфолипидных везикул (липосом)

Electrical breakdown of the membrane of liposomes
Changes in light transmittancc of liposomal suspension on the addition of СССР (100 nmol/1).
Liposomes (0.2 mg/ml) were formed from egg lecithin in sucrose solution (10 mmol/I) with KAc added:
a — 5 mmol/I, b — 15 mmol/I, с — 40 mmol/I.

Электрический пробой мембран липосом

Электрический пробой мембран липосом

20% холестерина
0% холестерина
AcOK (мМ)
Потенциал на мембране (мВ)
Влияние холестерина на пробой в липосомах

Breakdown of membrane during continuous introduction of KAc
Time-course of light transmittance (T) in the liposomal suspension (a) and the calculated membrane potential (b) during continuous introduction of concentrated potassium acetate solution. Liposomes (0.2 mg lipids/ml) prepared from egg lecithin were formed in 10 mmol/1 sucrose solution. Final concentration of CCCP was 0.1 mmol/l.

Холестерин увеличивает электрическую прочность мембран липосом
Потенциал пробоя (мВ)
Холестерин / фосфолипиды (моль / моль)

Снижение мембранного потенциала в липосомах при пероксидации липидов
Доза (Дж / см2)
Потенциал пробоя (мВ)
Продукты ПОЛ (мл)
Слева – При УФ-облучении разными дозами.
Справа – Про добавлении водорастворимых продуктов пероксидации липидов.

Детергенты снижают электрическую прочность мембран липосом
SDS
CTAB
Triton X-100
Логарифм молярной концентрации детергента
Потенциал пробоя (мВ)

Электрический пробой мембран эритроцитов

Электрический пробой мембран эритроцитов

[Cl]i and [C1]o, Cl- -concentrations in the cells and in the surrounding isotonic medium, respectively; фm [Сl-], membrane (chlorine) potential as calculated by the Nernst equation on the basis of (Сl-)i/(Cl-)o ratio; фm (H+), membrane potential as calculated from the ΔрН value arising in the medium after the addition of erythrocytes. The breaks on the curves attest to increased cationic permeability of the membranes. 1, Original erythrocytes; 2, Erythrocytes after UV-induced lipoperoxidation. Note that the peroxidation decreased the critical potential from ф2* = 110 to ф2* = 93 mV.
Electrical breakdown of erythrocyle membranes by chlorine diffusion potential.

Растяжение мембран эритроцитов снижает потенциал пробоя

Release of hemoglobin from erythrocytes

Электрический пробой мембран митохондрий

Электрический пробой внутренней мембраны митохондрий

Membrane potential changes in mitochondria upon their energization, the addition of permeant acid, and electrical breakdown, as assessed from variations in the fluorescence intensity of the probe diS-C3-(5). Precalibration of de-energized mitochondria in a KCl + valinomycin system enabled the variation in fluorescence to be expressed in membrane potential units (фm, mV). Δфs is the change in potential inside the mitochondria after the addition of succinate to the mitochondrial suspension containing rotenone; фA is the change in potential after the addition of potassium acetate (AcOK). When the membrane is broken down electrically, i.e. when δфA≥ф*, the membrane potential falls (β).

o
1
2
tg
α
180
190
200
210
Потенциал на мембране (мВ)
1.0
0.1
10
Концентрация соли (мМ)
Скорость падения мембранного потенциала (tg α) при различных потенциалах на внутренней мембране
Tg α (см. предыдущий слайд) – жто скорость падения мембранного потенциала в результате электрического пробоя.
Добавление KCl не создает дополнительного потенциала на мембране и не приводит к пробою. При добавлении ацетата пробоцй наступает при мембранном потенциале выше 200 мВ.

При добавлении сукцината (S), а потом - ацетата (AcOK) создается мембранный потенциал, величина которого растет с увеличением концентрации AcOK. При больших концентрациях AcOK (8 и 20 мМ) и, следовательно, - высоких потенциалах (>200 мВ) происходит пробой мембраны и наблюдается набухание митохондрий (tga > 0).
Набухание митохондрий в результате электрического пробоя
Светопропускание
Внизу дана зависимость скорости набухания митохондрий (tga) от концентрации ацетата.
После УФ облучения потенциал пробоя снижается.
Цифры у кривых – доза УФ в милли Эйнштейнах на м2.
Мембранный потенциал
Пробой
Пробой
Пробой