Влияние РНК-интерференции на экспрессию гена AML1-ETO

Цель:
оценка эффективности подавления экспрессии гибридного гена aml1-eto с помощью РНК-интерференции в клетках ОМЛ линий Kasumi-1 и SKNO-1.

Задачи:
Оценить эффективность подавления экспрессии гибридного гена aml1-eto в клетках ОМЛ линий Kasumi-1 и SKNO-1 с помощью РНК-интерференции, запускаемой кшРНК.
Синтезировать и клонировать последовательность, кодирующую искусственные анти-AML1-ETO микроРНК.
Разработать челночный плазмидный вектор pDsRed1/amiAML1-ETO, кодирующий искусственные
анти-AML1-ETO микроРНК, и изучить его функциональную активность.
Оценить эффективность подавления экспрессии гибридного гена aml1-eto в клетках ОМЛ линий Kasumi-1 и SKNO-1 с помощью РНК-интерференции, запускаемой искусственными анти-AML1-ETO микроРНК.

Основные понятия:
РНК-интерференция — это механизм подавления экспрессии гена, то есть проявления данного гена в организме в форме определенного признака на стадии трансляции.
МикроРНК — класс некодирующих РНК, которые имеют длину около 22 нуклеотидов. Эти РНК играют важную роль в регуляции трансляции и деградации мРНК.
кшРНК – то же, что и микроРНК, но внеклеточного происхождения, то есть, не кодируются геномом клетки и не проходят процессинг в ядре.

Схема строения лентивирусных векторов доставки pHR’SINcPPT-SEW (А) и
pHR-shAML1/ETO (Б).
А)
Б)

Эффективность трансдукции клеток линий Kasumi-1 (А) и
SKNO-1 (Б) VSV-G псевдотипированным лентивирусом, основанным на векторе рHR-shAML1/ETO.
Б)

Искусственное подавление белка AML1-ETO с помощью anti-AML1-ETO коротких интерферирующих РНК в клетках острого миелоидного лейкоза линий Kasumi-1 (А) и SKNO-1 (Б).

F_AML1-ETO
⎡BamHI⎤ ⎡перекрывающаяся область⎤
5’-ATGGATCCAGTGAGCGCACCTCGAAATCGAATACTGAGAAGGGTGAAGCCACAGATG-3’
R_AML1-ETO
⎡ SalI ⎤ ⎡перекрывающаяся область⎤
5'-GTCGTCGACAGTAGGCAAACCTCGAAATCGTACTGAGAAGACATCTGTGGCTTCACCCT-3'
Б)
а)
Сиквенс олигонуклеотидов и их вторичная структура, рассчитанная с помощью программного пакета Mfold 3.2 ([Na+] = 60 mM, [Mg2+] = 1.5 mM и +37oC).

Карта челночного плазмидного вектора pDsRed1-С1.

А)
Б)
Вторичные структуры DsRed1 mRNA (А) и DsRed1/AML1-ETO mRNA (Б), рассчитанные с помощью программного пакета Mfold
Б)

Результаты котрансфекции челночными плазмидными векторами
pDsRed1-C1, pDsRed1/amiAML1-ETO и
pEGFP-C1 клеток линии 293Т НЕК

A)
Б)
Схема строения лентивирусных векторов доставки
pHR-CMV-DRep (A) и pHR-CMV-DRep/amiAML1-ETO (Б)

Эффективность трансдукции клеток линий Kasumi-1 и SKNO-1 DRep/Control/v.01 и
pHR-DRep/amiAML1-ETO/v.01
VSV-G-псевдотипированными лентивирусами.

Стабильность наследования лентивирусных векторов DRep/Control/v.01 и
pHR-DRep/amiAML1-ETO/v.01 в клетках линий Kasumi-1 и SKNO-1, интегрировавшихся в геном.

Выводы были озвучены по ходу доклада.

автор благодарен
С.В. Глушену за помощь в проведении микроскопических исследований
И.Н. Северину за помощь в проведении цитометрических исследований
D. Trono за предоставленные вектора pCMV_dR8.91 и pMD2.G
M. Scherr за базовый лентивирусный вектор доставки pHR-SINcPPT-SIEW
O. Heidenreich за векторы pHR’SINcPPT-SEW и pHR-shAML1/ETO
сотрудникам лаборатории клеточной и молекулярной биологии лейкозов за помощь в проведениях исследований