Задачи химической модификации белков

Примеры применение метода химической модификации белков
Отслеживание in vivo конъюгатов белков с флуорофорами
Пегилирование белков с целью снижения иммуногенности
Получение белков с новыми свойствами
Изучение механизма действия ферментов при патологиях
Биоконъюгация

Методы обнаружения «существенных» и «избыточных» а.о.
1. Направленный (сайт-специфический) мутагенез.
2. Химическая модификация боковых групп а.о.
Задачи химической модификации белков
1. Поиск функционально значимых групп. 2. Создание необратимых ингибиторов ферментов. 3. Изучение топографии поверхности белковых молекул и их локализации в надмолекулярных структурах.
Пример.
Модификация диизопропилфторфосфатом остатков Ser в активном центре сериновых протеиназ.

Типы химических модификаций
1. Модификация отдельных а.о. с помощью
селективных химических реагентов.
2. Модификация двух функциональных групп с
помощью бифункциональных химических
реагентов.
3. Направленная или биоспецифическая
модификация (аффинное мечение).

Особенности химической модификации белков
Химические свойства идентичных функциональных групп в аминокислотах и в белках различаются по следующим причинам:
а) часть функциональных групп скрыта внутри белковой глобулы и недоступна для химических реагентов;
б) локальные изменения полярности (гидрофобности) микроокружения функциональной группы также могут изменять её реакционную способность;
в) различные участки поверхности белковой глобулы могут сорбировать химические реагенты, что приводит к локальному повышению концентрации реагента и и возможности побочных реакций;
г) химические реакции могут влиять на конформацию молекулы белка;
д) многие функциональные группы в белках контактируют с соседними группировками, образуя своеобразные ансамбли.

Условия среды для химических модификаций природных белков
< 370C
pH 6-8
реакция в водном растворе

Подход, основанный на модификации метки («tag-and-modify» approach)
C.D.Spicer, B.G.Davis. Selective chemical protein modifications.
Nature Communications, 2014, 5739-5740.
иммобиолизация
гликозилирование
пегилирование
пренилирование
конъюгация с антителом
пептид
биотинилирование
флуорофор

Функциональные группы белков,
которые могут быть модифицированы
1. α-NH2 –группа и ε-NH2-группа остатков Lys.
2. Вторичная аминогруппа остатков His.
3. Сульфгидрильная группа (–SH) остатков Cys.
4. Дисульфидные мостики цистиновых остатков.
5. Тиоэфирная группа остатков Мet.
6. Оксифенильная группа (-С6H4-OH) остатков Tyr.
7. Индольная группа боковой цепи остатков Trp.
8. Гуанидиновая группа остатков Arg.
9. Карбоксильные группы боковых цепей остатков Asp и Glu.
10. Гидроксильные группы боковых цепей остатков Tyr и Ser.
Остатки Gly, Ala, Val, Leu, Ile, Phe, Pro, Asn, Gln, Sec, Pyl модификации не подвергаются.

Химическая модификация аминогрупп
Типы аминогрупп в белках:
1) α-NH2–группа N-концевого а.о., pKa 6,8-7,6;
2) ε-NH2–группа боковой цепи остатка Lys, pKa 9,5-10,5;
3) вторичная аминогруппа имидазольного кольца остатка His, pKa 7,2-7,6.
Понижая рН раствора до 7,0 можно избежать модификации
ε-NH2–групп боковой цепи остатка Lys.
Lys His

ε-NH2–группа боковой цепи остатка Lys может быть модифицирована следующими методами:
1) ацилирование;
2) арилирование;
3) реакция с имидоэфирами;
3) алкилирование или восстановительное алкилирование;
4) карбомоилирование;
4) амидирование;
5) гуанидинирование;
6) образованием Шиффовых оснований;
7) дансилирование
и др.
Химическая модификация остатков Lys

Ацилирование ε-NH2–группы Lys
Ацилирование можно вести с помощью:
1) симметричных ангидридов (уксусного, трифторуксусного, янтарного, малеинового, цитраконового);
2) смешанных ангидридов (карбоксиангидридов);
3) активированных сложных эфиров.
Всегда требуется большой избыток ацилирующего агента, т.к. основной побочной реакцией является его гидролиз.
Скорость гидролиза уменьшается в ряду:
R-COCl > R1-CO-O-CO-R2 > R1-CO-O-R2

ХИМИЧЕСКАЯ МОДИФИКАЦИЯ ОСТАТКОВ Lys
Ацилирование
Замена заряда с +1 на -1 вызывает большие конформационные изменения.
Основной побочной реакцией является необратимое алкилирование SH-групп остатков Cys.

Химическая модификация Lys
а) ацилирование S-этил-трифторацетатом
д) гуанидинирование О-метилизомочевиной
б) арилирование 2,4-динитрофторбензолом
в) реакция с имидоэфирами,
образование амидинов
г) образование оснований Шиффа
е) карбамоилирование
восстановительное алкилирование
гомоаргинин

Модификация остатка His
а) реакция с диазотетразолом
б) реакция с диэтилпирокарбонатом

ХИМИЧЕСКАЯ МОДИФИКАЦИЯ ОСТАТКОВ Arg
1975 г. Л. Патти, Э. Смит
Конденсация с 1,2-дикетонами
1,2-циклогександион
Аргинин можно легко регенерировать при действии гидроксиламина при pH 7,0, 370C в течение 7-8 часов

Химическая модификация Arg
реакция с
нитромалоновым
альдегидом
а) реакция с тетраэтоксипропаном
с образованием пиримидиновых производных
б) реакция с
фенилглиоксалем
в) гидразинолиз
с образованием орнитина

Модификация остатков Ser и Thr
Из-за низкой реакционной способности первичных спиртовых групп Ser и Thr специфическая модификация этих остатков невозможна. Функционально важный остаток Ser в активном центре сериновых протеаз можно специфически промодифицировать диизопропилфторфосфатом:
диизопропилфторфосфат

Модификация остатков Asp и Glu
Реакции этерификации:
б) диазоацетамидом
а) хлористым водородом в метаноле или диазометаном
в) борфторидом этилоксония

Модификация остатка Met
Алкилирование иодацетамидом с образованием карбоксиметилсульфониевой соли

Модификация сульфгидрильных групп цистеина
а) алкилирование иодуксусной кислотой или иодацетамидом;
б) аминоэтилирование этиленимином (не показана);
в) реакция с п-хлормеркуриобензойной кислотой;
г) окисление с помощью О2 до цистеиновой кислоты;
д) окисление с образованием дисульфидных связей в присутствии феррицианида;
е) реакция с азобензол-2-сульфенилбромидом;
ж) реакция с N-этилмалеимидом;
З) пиридилэтилирование 4-винилпиридином (не показана).

ХИМИЧЕСКАЯ МОДИФИКАЦИЯ ОСТАТКОВ Cys
азациклопропан,
азиридин

Модификация дисульфидных групп цистина
а) восстановление дитиотреитолом, меркаптоэтанолом или другими тиолами;
б) окислительный сульфитолиз;
в) расщепление цианидами;
г) окисление надмуравьиной кислотой.

Титрование белка реактивом Эллмана -
5,5’-дитио-бис-(2-нитробензойной кислотой)
Дисульфидный обмен при pH>7,0
Тионитробензойная кислота обладает сильным поглощением при 412 нм и определяется количественно спектрофотометрически.

Модификация остатка Trp
а) реакция с
N-бромсукцинимидом;
б) алкилирование 2-гидрокси-
5-нитробензилбромидом;
в) реакция с
2-нитросульфенилдхлоридом;
г) формилирование безводной муравьиной кислотой, насыщенной HCl;
д) фотоокисление или озонолиз.

Модификация остатка Tyr
а) иодирование I+ (I- +
N-хлортолуолсульфамид натрия);
б) окислительное бромирование
N-бромсукцинимидом;
в) реакция с цианурфторидом для спектрофотометрического определения числа остатков Tyr;
г) ацетилирование
N-ацетилимидазолом;
д) нитрование
тетранитрометаном.

Кросс-сшивающие или бифункциональные реагенты
Кросс-сшивающими или бифункциональынми реагентами называются соединения с двумя реакционноспособными группами.
Общая формула этих соединений X-R-Y, где X и Y – химически активные группы, а R – так называемая «ножка».
Бифункциональные реагенты используются для ковалентной сшивки пространственно сближенных участков как одной молекулы, так и двух разных белков, функционирующих в едином комплексе.

Специфичные бифункциональные реагенты
n=1 длина сшивки 5A; n=2 6A; n=3 8A; n=4 9A; n=5 10A; n=6 11A;
Взаимодействует с сульфгидрильными группами
Взаимодействуют с аминогруппами Диимидоэфиры (бис-карбоксиимидаты)

Расщепляемые бифункциональные реагенты
Использование расщепляемых реагентов облегчает процесс идентификации
сшиваемых с их помощью участков одного белка или различных белков при исследовании многокомпонентных белковых систем.

Биоспецифическая модификация белков
Реакционноспособные
аналоги субстратов или других лигандов могут взаимодействовать с а.о. в активном центре фермента или белка-рецептора.
Такие реагенты называются субстратоподобными.