Иммунитет. Как защититься от защиты?

Проблема и ее анализ
ПРОБЛЕМА
Создание тест системы для определения предрасположенности к неправильному питанию на основе ПЦР диагностики вариантов гена-вкуса htas2r38
Делаем жизнь
человека безопасной
СУЩЕСТВУЮЩИЕ РЕШЕНИЯ
ВОЗМОЖНЫЕ РЕШЕНИЯ
АКТУАЛЬНОСТЬ
В настоящее время популярно мнение о том, что иммунитет человека нуждается в постоянной стимуляции. Однако, в результате этого множество людей начинают страдать от аутоиммунных заболеваний и системных воспалений.
Механизм влияния активированных клеток на здоровые ткани и работа иммунитета в целом очень мало изучены, однако их понимание является важным элементом обеспечения безопасного существования человека.
Подавление иммунных реакций – иммунная супрессия.
Изучение влияния активированных иммунных клеток на другие клетки организма, не нуждающиеся в нем, и последующий поиск возможных блокаторов этих реакций.

ЦЕЛЬ ПРОЕКТА
ц
Изучение влияния активированных иммунных клеток на другие клетки организма на примере эндотелия и фибробластов
ЗАДАЧИ ПРОЕКТА
Выделение, активация иммунных клеток и оптимизация этих процессов (CD3 – Т-клетки).
Изучение влияния активированных Т-клеток на клетки эндотелия сосудов (сердечные микроваскулярные клетки и клетки аорты).
Изучение влияния активированных Т-клеток на фибробласты (кожные и лёгочные).
Создание тест системы для определения предрасположенности к неправильному питанию на основе ПЦР диагностики вариантов гена-вкуса htas2r38
Делаем жизнь
человека безопасной
Цели и задачи проекта

Проточная цитофлуориметрия (FACS)
Иммуноферментный анализ (ELISA)
Флуоресцентная микроскопия
Искусственная активация клеток и ведение совместных культур
Флуорисцентная микроскопия
МЕТОДЫ
МАТЕРИАЛЫ И ОБОРУДОВАНИЕ
ELISA
FACS
Методы, материалы
и оборудование
Иммунитет. Как защититься от защиты?
Делаем жизнь
человека безопасной

Культивирование клеток
MACS (магнитный сортинг специфических субпопуляций клеток)
Окрашивание MitoSOX на АФК (образование супероксида)
Работа проводилась на культурах человеческих клеток дермальных, фетальных дермальных и легочных фибробластов и сердечных микроваскулярных эндотелиальных клетках и клетках эндотелия аорты методом совместных культур с активированными Т-клетками человека.
МЕТОДЫ
МАТЕРИАЛЫ И ОБОРУДОВАНИЕ
Методы, материалы
и оборудование
Иммунитет. Как защититься от защиты?
Делаем жизнь
человека безопасной

ОСНОВНАЯ СХЕМА ЭКСПЕРИМЕНТОВ
Методы, материалы
и оборудование
Иммунитет. Как защититься от защиты?
Делаем жизнь
человека безопасной
T-клетки человека
MACS
CD4+ T-клетки
CD8+ T-клетки
Проверка пролиферации (CFSE)
Культуры клеток человека
Активация Dynabeads

СВЕТОВАЯ МИКРОСКОПИЯ
Анализ морфологии клеток через 24 часа
Методы, материалы
и оборудование
Иммунитет. Как защититься от защиты?
Делаем жизнь
человека безопасной
Отрицательный контроль
Контроль с бидсами
Клетки с CD8
Клетки с CD4
Клетки с CD4 и CD8
Положительный контроль с TNFα

Результаты работы
MitoSOX - анализ стресса в клетках эндотелия
MitoSOX – вещество, которое при взаимодействии с супероксидом (перекись водорода) меняет свой цвет на красный. Клетки, которые стрессуются, выделяют именно такой вид оксида, поэтому с помощью MitiSOX-а можно регистрировать стресс клеток.
Окрашивание HCMVECs
blue – DAPI
red - MitoSOX
Иммунитет. Как защититься от защиты?
Делаем жизнь
человека безопасной
ctr
TNFα
T cells

Результаты работы
Анализ стресса в фибробластах
Иммунитет. Как защититься от защиты?
Делаем жизнь
человека безопасной
αSMA - green
Phalloidin – red
DAPI – blue
К фибробластам слева лимфоциты не добавлены, а справа- добавлены.

Детекция молекул адгезии в эндотелиальных клетках
Окрашивание на CD31 –
маркер эндотелиальных клеток
Определение субпопуляции нужных клеток по светорассеиванию
Выбор отдельных клеток (исключение дубликатов и кластеров)

Детекция молекул адгезии в эндотелиальных клетках

ELISA по TNF-α (фактор некроза опухоли)
Эндотелий
Фибробласты

Выводы и анализ результата
ВЫВОДЫ И АНАЛИЗ РЕЗУЛЬТАТА
Иммунные клетки (CD4 и CD8) были выделены и активированы самым эффективным способом (пролиферация до 3х циклов деления у 90% клеток) способом. Для этого использовалось магнитная MACS сепарация.
Было выявлено отрицательное влияние гиперактивированных Т-клеток на здоровые клетки эндотелия, наблюдаемое в результате изменения морфологии и интенсивного выделения веществ, характерных для клеток, находящихся в состоянии стресса.
Было выявлено отрицательное влияние активированных Т-клеток на здоровые фибробласты, наблюдаемое в результате изменения морфологии и интенсивного выделения веществ, характерных для клеток, находящихся в состоянии стресса.
Создание тест системы для определения предрасположенности к неправильному питанию на основе ПЦР диагностики вариантов гена-вкуса htas2r38
Делаем жизнь
человека безопасной
Активация иммунитета является необходимым фактором защиты организма, но несвоевременная искусственная гиперактивация может быть опасной для здоровых клеток организма и приводить к непредвиденным последствиям.