Индивидуальная работа. Генетические коллекции гороха

Горох (лат. Písum) — род травянистых растений семейства Бобовые (Fabaceae).
Научная классификация
Домен: Эукариоты
Царство: Растения
Отдел: Цветковые
Класс: Двудольные
Порядок: Бобовоцветные
Семейство: Бобовые
Род: Горох
Род включает семь видов:
Pisum abyssinicum A.Braun
Pisum ensifolium (Lapeyr.) E.H.L.Krause
Pisum fulvum Sibth. & Sm.
Pisum heterophyllum (L.) E.H.L.Krause
Pisum hirsutum (L.) E.H.L.Krause
Pisum pumilio (Meikle) Greuter
Pisum sativum L.— Горох посевной

Ботаническое описание
Виды рода Горох — однолетние травы со слабыми вьющимися стеблями.
Листья перистые и заканчиваются ветвистыми усиками, с помощью которых они цепляются за другие растения. Прилистники особенно велики.
Цветки с венчиком мотылькового типа. Родовым отличительным признаком в цветке служит трёхрёберный столбик с желобком внизу и пучком волосков вверху.
Формула цветка:
Плод — плоский двустворчатый боб с семенами-горошинами. Горошины обычно сферической или несколько угловатой формы.

Горох – самый распространенный из всех бобовых. Все сорта делятся на две группы: сахарные и лущильные. У сахарных - плоды на ранней стадии зрелости можно употреблять вместе со стручками (створками). У лущильных - из-за имеющегося жесткого слоя (пергаментного) эти створки несъедобны.
Горох – очень древний продукт питания, что подтверждают постоянно археологи. На Руси этот овощ использовался повседневно еще «при царе Горохе». Считался необходимой и обыденной едой вплоть до момента, когда из Голландии (17 век) был привезен новый сорт – сахарный (зеленый горошек), который надолго стал едой для дворянства, а не для простолюдинов. На сегодняшний день этот сорт считается популярным и полезным лакомством.

В настоящее время в мировых генбанках продовольственных зерновых бобовых культур сохраняется более 900 тыс. образцов или 15% от общего числа образцов по всем культурным растениям и их диким сородичам. В Европейских генбанках хранится следующее количество образцов гороха — 47450.
Зерновые бобовые растения имеют толстую семенную кожуру, что препятствует излишней потере влаги и поддерживает хорошую жизнеспособность во время хранения и транспортировки. Семена бобовых хорошо хранятся при низких температурах и низкой влажности и их жизнеспособность может сохраняться в течение многих столетий при идеальных условиях хранения.
Всего в Европе насчитывается 236 генбанков, в которых хранятся коллекции зерновых бобовых культур.

Различают 3 типа коллекций культурных растений и их диких сородичей
Базовые коллекции - стратегические, длительно хранящиеся обычно при температуре > -18°С при предварительном высушивании до установленной влажности. Эти коллекции служат страховочным материалом для активной и рабочей коллекций.
Активные коллекции в целом поддерживаются при умеренных сроках хранения при температуре < 4°С и относительной влажности 15%. Их принципиальная роль — удовлетворение спроса на материал, поступающий из базовой коллекции. Здесь проводится работа по характеристике образцов для удовлетворения требований селекционеров или научно-исследовательских групп. Эта работа требует междисциплинарного подхода; она охватывает изучение коллекции, интегрированную в фундаментальные и прикладные научные программы.
Рабочие коллекции являются краткосрочными и создаются для специфических групп пользователей (селекционеры и специализированные исследовательские группы). Неспециализированный обычный спрос из нее не удовлетворяется.

Ко-коллекции
(core collections) созданы для улучшенной оценки пользовательных коллекций, которые включают только ограниченное число образцов. В ко-коллекции инкорпорирован самый широкий круг генетического разнообразия внутри вида в ограниченном числе линий. В частности, в институте Джона Иннеса в Великобритании создана ко-коллекция образцов гороха — доноров генов устойчивости к различным болезням.
Число образцов, входящих в специализированную группу ко-коллекции, зависит от их характеристик. Например, специализированная генетическая коллекция гороха в этом институте поддерживается внутри главной коллекции и включает в себя всего 330 генетических линий, регистрируемых в качестве доноров определенных аллелей с перечнем генов гороха. Таким образом, ко-коллекции являются надежным источником специфических аллелей для генетического анализа сцепления генов, тестов на аллелизм и других исследований.

С точки зрения селекционера генетические ресурсы можно разбить на 3 типа:
а) Ресурсы генбанков. Этот тип коллекции имеет самое большое генетическое разнообразие, но большинство гермплазмы, особенно, дикие образцы, очень далеки от возделываемых сортов. В силу этого, селекционные программы по интрогрессии такого материала в новые сорта слишком долговременные и неохотно финансируются, однако сроки могут быть сокращены за счет углубления и расширения информации об образцах генбанков.
б) Коллекции селекционные включают все материалы, созданные селекционером путем гибридизации и полученные из генбанков. Они хорошо изучены, включают специфические признаки и более приближены к культурному типу. Этот тип коллекции в наибольшей степени используется селекционером и требует большой работы по ее созданию и поддержанию.
в) Культурные сорта очень легко интегрировать в селекционные программы и на их основе в короткие сроки создавать сорта с улучшенными признаками, хотя при этом в сильной степени сужается генетическое разнообразие. Этот тип материала чаще всего используется селекционерами по экономическим причинам, т. к. краткосрочные селекционные программы финансируются в первую очередь.

Схема передачи селекционерам исходного материала гороха во Франции
На схеме приведен пример организации помощи селекционерам по использованию генетической коллекции гороха во Франции, которая в насоящее время занимает в Европе и мире ведущее место по производству и экспорту зерна гороха.
На схеме показана роль группы селекционеров гороха (GSP), цель которой заключается в передаче научных знаний практическим селекционерам. Для этого материал берут из генбанков, изучают в течение 1—2 лет и затем выдают селекционерам достоверную информацию.

Ежегодно пополняется генофонд Национального центра генетических ресурсов растений Украины, созданный в 1995 году при институте растениеводства им. В. Я. Юрьева в г. Харькове. В контрастных погодных условиях 1997—1999 гг. предпринят системный подход к поиску исходного материала для селекции зерновых бобовых культур на устойчивость к массовым вредителям и болезням. Изучение и оценка новых образцов из генбанка осуществляется на жестком инвазионном фоне, состоящем из 7 вредителей (гороховая тля, гороховая и фасолевая зерновка, 2 вида клубеньковых долгоносиков, гороховая плодожорка, бобовая огневка и клещ) и 8 болезней (фузариоз — 5 видов, аскохитоз и бактериоз — 2 вида). Всего оценено на устойчивость к комплексу болезней и вредителей 16000 сортов и линий гороха, сои, фасоли, чечевицы и нута из 30 стран мира.

Производство гороха в мире постоянно растет. "Горохова революция", которая состоялась в ряде стран Европейского Союза, в первую очередь во Франции, за последние 20 лет в большей степени обязана достижениям селекции высокоурожайных сортов с новыми морфотипами - безлисточкового, с детерминантный типом роста и др., Обеспечивающих использование высоких технологий при их выращивании. Так, безлисточкови сорта в странах ЕС занимают 80% всей площади выращивания зернового гороха.
Следует отметить, что в связи с глобальным потеплением климата, зоны Степи и Левобережной Лесостепи Украины возникают более аридных (сухими) и неблагоприятными для выращивания гороха, площади и производство которого в последние несколько лет в этих регионах резко сократились.

Генетическая карта гороха
Для генетической локализации генов гороха и их последующего клонирования был создан набор ген-специфичных молекулярных ДНК-маркеров. Использование данного типа маркеров позволяет картировать гены гороха и выявлять гены-кандидаты в гомологичных районах геномов модельных бобовых растений люцерны слабоусеченной (Medicago truncatula Gaertn.) и лядвенца японского (Lotus japonicus (Regel.) Larsen). Созданный набор маркеров может быть использован для локализации любых мутаций в геноме гороха, поиска генов-кандидатов и секвенирования генов интереса, затронутых мутациями.

Коллекции мутантов гороха

Роль гена Pssym40 в регуляции развития арбускулярной микоризы и его взаимодействие с другими регуляторными генами гороха посевного.
Мутанты гороха по генам Pssym33 и Pssym40 имеют нарушения образования азотфиксирующих клубеньков, а растения линий SGEFix"-2 (Pssym33) и SGEFix"-l (Pssym40), кроме того, характеризуются нарушениями развития, но не функционирования арбускулярной микоризы (AM). Выяснено, что гены гороха Pssym33 и Pssym40 контролируют две последовательные стадии образования бобово-ризобиального симбиоза, причем мутация в гене Pssym33 блокирует этот процесс на более ранней стадии. Взаимодействие симбиотических генов гороха Pssym33 и Pssym40 в ходе развития AM симбиоза было охарактеризовано с использованием двойного симбиотического мутанта RBT3 (Pssym33, Pssym40).

Проведены скрещивания новой серии симбиотических мутантов с исходной линией SGE и проанализированы по фенотипу потомство F1 и F2. На основе проведенного гибридологического анализа была выяснена генетическая детерминация 4 Nod- (неспособных к клубенькообразованию) и 6 Fix- (формирующих неэффективные клубеньки) мутантных фенотипов. Было показано, что Fix- мутанты RisFixA и RisFixV принадлежат к 2 новым группам комлементации: sym41 и sym42, соответственно. Был проведен морфологический анализ серии симбиотических мутантов гороха, неспособных к клубенькообразованию (Nod- фенотип) и выявлены стадии инфекции и развития тканей клубенька, блокированные изученными мутациями:
1) блоки кортикальных клеточных делений (Ccd-)и колонизации скрученных корневых волосков (Crh-) у мутантов RisNod14 (sym7) и SGENod--6 (sym7),
2) блоки кортикальных клеточных делений (Ccd-) и инициации роста инфекционных нитей (Iti-) у мутантов SGENod--1 (sym35), SGENod--2 (sym14), SGENod--3 (sym35), RisNod8 (sym35),
3) блоки роста инфекционной нити в клетке корневого волоска (Ith-) и развития клубеньковой меристемы у мутантов RisNod4 (sym37), SGENod--4 (sym38), SGENod--8 (sym38), RisFixF (sym38),
4) блоки роста инфекционной нити в кортексе корня (Itr-) и развития клубенькового примордия (Npd-) у мутантов RisNod1 (sym34), RisNod23 (sym34).

В результате анализа была предположена относительная независимость выполнения генетических программ инфекции и развития тканей клубенька при наличии взаимного контроля развития каждой программы, а также выявлены гены, участвующие в развитии обеих программ. Также были изучены ранние стадии инфекции у симбиотических мутантов, блокированных на поздних стадиях развития симбиотических клу беньков: SGEFix--1 (sym40), SGEFix-- 2 (sym33), RBT3 (sym33, sym40). Было показано, что у мутанта SGEFix--1 количество инфекционных нитей было увеличено по сравнению с исходной линией, а у мутанта SGEFix--2 снижено, также как и у двойной линии RBT3, что свидетельствует об эпистатировании мутации в гене sym33 над мутацией в гене sym40 в отношении числа инфекционных нитей на начальных стадиях инфекции. Симбиотический локус sym38 (мутант SGENod--4) был локализован в 5 группе сцепления гороха. Был проведен анализ развития микоризы у симбиотического мутанта RisFixA (sym41). В результате было выявлено, что ген Sym41 вовлечен как в развитие симбиотических клубеньков, так и в развитие микоризы.

У гороха посевного описан мутант SGECdt (cdt), характеризующийся повышенным уровнем накопления кадмия и устойчивостью к данному тяжелому металлу, по сравнению с исходной линией. Проведенный ранее SSAP анализ позволил локализовать локус cdt в VI группе сцепления гороха. Для более подробного картирования локуса cdt были разработаны молекулярные маркеры, основанные на известных последовательностях генов гороха, выявленных с помощью анализа геномной микросинтении между горохом посевным и модельным бобовым Medicago truncatula. Было выявлено тесное сцепление локуса cdt и маркеров, разработанных на основе генов Pentatricopeptide repeat и Exosome complex exonuclease RRP45. Таким образом, были созданы условия для дальнейшего позиционного клонирования гена cdt.
Проведен химический мутагенез лабораторной линии гороха SGE с использованием этилметансульфоната. При анализе 425 семей (2069 растений) поколения М2 было отобрано 45 потенциальных симбиотических мутантов, из них 30 мутантов, формирующих неэффективные клубеньки (фенотип Fix-), 13 мутантов, неспособных формировать клубеньки (фенотип Nod-) и 2 мутанта, формирующих единичные клубеньки (фенотип Nod+/-). Для 1 Nod- и 5 Fix- мутантов было показано моногенное наследование и рецессивное проявление мутантных признаков. Для Fix- мутанта SGEFix--9 показано присутствие дополнительной мутации, приводящей к фенотипу Nod+/-. Комплементационный анализ показал, что мутантный фенотип линии SGEFix--5 определяется мутацией в гене sym33, линии SGEFix--6 - в гене sym40, линии SGEFix--7 - в гене sym27, и линии SGEFix--8 - в гене sym25.

Мутация у гороха Pisum L. в локусе Тl
Получен новый мутант гороха с многократно непарноперистым типом листьев. Сложный лист мутанта отличается от листьев ранее известных образцов с многократно непарноперистым типом листьев тем, что листовые пластинки мутанта очень узкие, удлиненные и склонны к сплетению. Установлено, что появление новой формы многократно непарноперистых листьев обусловлено мутацией в локусе TL (хромосома 7), которая не аналогична мутации «акация Уайта» tlw или «акация Ламма» tlpet. Установлена рецессивная природа нового мутантного гена относительно аллеля tlw. Для нового мутантного гена предложено обозначение tlUL. Получены генотипы с новым типом акациевидных листьев (tlUL tlUL Af–).