Изменение экспрессии генов серотониновой системы под действием разной хронической нагрузки у крыс

Актуальность
5-Нt4-рецептор является метаботропным, при активации повышающим количество цАМФ в клетке, что в свою очередь запускает каскад реакций, ведущий к выбросу нейромедиатора.
Особое значение в правильном функционировании СТС имеет инактивация высвобожденного 5-Нt, где функционирует транспортер обратного захвата серотонина – 5-Htt, являющийся продуктом гена Slc6a4. Относящийся к семейству белков-транспортёров моноаминов, осуществляющий обратный захват и транспорт серотонина из синаптической щели обратно в выделивший его пресинаптический нейрон.
Фермент Tph является фактором, ограничивающим скорость биосинтеза нейротрансмиссии 5-Ht, и играет ключевую роль в регулировании доступности, обмена и функции серотонина
Показано, что острый и хронический стресс вызывает изменение уровня серотонина, посредством подавления Tph, изменения концентрации его переносчика Slc6a4, числа пре- и постсинаптических серотониновых рецепторов, что, первую очередь является факторами, детерминирующими предрасположенность к развитию депрессии и другим психическим расстройствам. Поэтому изучение экспрессия генов серотониновой системы является одним из новых биомаркеров, позволяющих оценивать общее состояние организма, прогнозировать возникновение некоторых заболеваний и их исходов.
Структура серотонинового синапса

Задачи:
1. Оценить изменения экспресии генов Tph1 и Tph2, Htr4, Slc6a4 на вивальной модели крыс линии Wistar в 4-х группах в динамике:
2. Оценить корреляционную зависимость между уровнем кортизола и изменением экспрессии генов СТ-системы.
3. Оценить изменения экспресии генов Htr4, Slc6a4, Tph1 и Tph2 на вивальной модели крыс линии Wistar между группами «ИС» «ФН» «ФН+ИС» относительно группы контроля.
Целью настоящей работы является изучение влияния различного вида хронического стресса (иммобилизации, физической нагрузки и комбинированного комплекса данных воздействий) в динамике через 3, 6 и 9 месяцев на изменение количества мРНК генов экспрессирующихся серотониновой системой.
б) Группа с изнурительной физической нагрузкой «ФН»
в) Группа с иммобилизационным стрессом «ИС»
г) Группа с комплексом хронических стрессоров
«ИС+ФН»
а) Контрольная группа

Методы. Работа с крысами
Для моделирования воздействия различных типов хронического стресса сформировано 4 группы крыс линии Вистар в возрасте 6 месяцев, подвергавшихся разным видам стрессорного воздействия на протяжении 9 месяцев. Первая группа («Контроль») содержалась в обычных условиях вивария без воздействия какой-либо нагрузки.
Животные второй группы («ФН») испытывали стресс в виде интенсивной физической нагрузки (7 минут с грузом 8% от массы тела) в водном лабиринте Морриса (Open Science, Россия).
У животных третьей группы («Иммобилизационный стресс», «ИС») хронический стресс вызывался ежедневной 90- минутной иммобилизацией в специальном пенале-фиксаторе (Open Science, Россия) в течение 14 дней.
Четвертая группа («ФН+ИС») включала комплексную комбинацию стрессовой нагрузки путем теста вынужденного плавания и иммобилизации.

Методы. Лабораторные работы
Относительный уровень экспрессии генов определяли на 3-й, 6-й и 9-й месяц эксперимента в образцах РНК, выделенных из венозной крови из хвостовой вены. Для синтеза кДНК использовали вырожденные праймеры с использованием MMLV RT kit. Относительный уровень экспрессии генов оценивали методом 2-ΔΔCt на основании результатов, полученных в ходе ПЦР в реальном времени. Корреляционную зависимость оценивали по коэффициенту корреляции Пирсона

Обнаружили прямую корреляционную зависимость между уровнем глюкокортикоида и экспрессией Slc6a4, в зависимости от типа стрессора и его продолжительности воздействия на организм
Корреляции между уровнем кортизола и экспрессией Htr4 не обнаружили

В данном исследовании показано отсутствие экспрессии генов Tph1 и Tph2 в периферической крови крыс, тогда как для генов Slc6a4 и Htr4 показаны статистически значимые изменения относительных уровней их активности
В динамике наблюдается тенденция к увеличению экспрессии генов Htr4 и Slc6a4 к 9 месяцу, с пиком активности в 6ом месяце эксперимента, и с небольшим уменьшением экспрессии после 3 месяцев воздействий в группе с иммобилизационным стрессом и с комплексом стрессоров (физический и иммобилизационный стрессор), тогда как в контрольной группе и группе с физической нагрузкой значимых изменений не выявлено в ходе проведения эксперимента по отношению к началу эксперимента.

Относительный уровень экспрессии гена Slc6a4 после 3, 6 и 9 месяцев воздействий между разными группами крыс
В сравнении с контрольной группой после 3 месяцев воздействий стрессовых факторов на организм можно наблюдать понижение относительного уровня экспрессии генов СТС во всех группах (в связи с чем с повышается риск развития депрессивноподобных состояний). При более долгом воздействии (6 мес.) стрессоров происходит повышение активности экспрессии во всех группах, кроме «плавцов», после 9 месяцев повышение уровня экспрессии можно наблюдать только у группы, наиболее сильно подверженных стрессорам – «ФН+ИС», тогда как и группа с ФН и группа с ИС сравняла уровень экспрессии с контрольной группой

Относительный уровень экспрессии гена Htr4 после 3, 6 и 9 месяцев воздействий между разными группами крыс
При изучении экспрессии рецепторного гена также наблюдается падение экспрессии во всех группах крыс после 3 месяцев эксперимента, но данная тенденция к падению активности экспрессии продолжается и к 6 месяцу. Однако, также как и с экспрессией переносчика серотонина более долгом воздействии (9 мес.) стрессоров происходит повышение активности экспрессии в группах с ИС – «ИС» и «ФН+ИС», тогда как и группа с ФН произошло сравнение уровня экспрессии с КГ.

Выводы
1. На вивальной модели крыс линии Wistar показано значимое изменение активности экспрессии генов СТС, как в динамике (после 3, 6 и 9 месяцев эксперимента), так и между различными группами крыс. В данном исследовании показано отсутствие экспрессии генов Tph1 и Tph2 в периферической крови крыс, тогда как для генов Slc6a4 и Htr4 показаны статистически значимые изменения относительных уровней их активности. В динамике наблюдается тенденция к увеличению экспрессии генов Htr4 и Slc6a4 к 9 месяцу эксперимента, с небольшим падением активности после 3 месяцев эксперимента в группе с иммобилизационным стрессом и с комплексом стрессоров (физический и иммобилизационный стрессор), тогда как в контрольной группе и группе с физической нагрузкой значимых изменений не выявлено.
2. Наиболее сильным изменениям экспрессии генов СТ системы в ходе проведения эксперимента относительно контрольной группы были подвержены группы крыс, где присутствует ИС- группы «ИС» и «ФН+ИС», наименьшим изменениям поддалась группа с изнурительной физической активностью «ФН».
3. На вивальной модели крыс показана прямая корреляционная зависимость между уровнем глюкокортикоидов крыс и экспрессии гена переносчика серотонина в контрольной группе на протяжении всего эксперимента, в группе с ФН после 3 и 6 месяцев эксперимента, а в группах «ИС» и «ИС+ФН» только после 3 месяцев эксперимента, тогда как между уровнем кортизола и экспрессией гена рецептора серотонина зависимость не выявлена.