Калориметрические методы анализа биомолекул

Синхронное изменение спектров триптофановой флуоресценции и кругового дихроизма при плавлении белка
Изменение подвижности белка в акриламидном геле в зависимости от концентрации мочевины
Плавление белка, как пример перехода по типу «Все или ничего»

Разница между «постепенным» переходом и переходом по принципу «все или ничего» отражается не в виде кривой Е(Т), а в функции распределения W(E) молекул по энергии

Холодовая денатурация

Структура белка после денатурации

Расплавленная глобула и её свойства

Почему белок плавится как единое целое?

Скорость сворачивания белка при его синтезе достаточно велика. Подобная самоорганизация белковых структур относится, с физической точки зрения, к классу явлений "возникновение порядка из порядка" (по классификации Пригожина): трехмерный "апериодический кристалл" (говоря словами Шредингера) структуры белка порождается заранее фиксированным порядком звеньев в его цепи.

Парадокс Левинталя
«С одной стороны, нативная пространственная структура по всем тестам ведет себя как самая стабильная из всех структур цепи: белковая цепь попадает в нее при разных кинетических процессах [и при сворачивании на рибосоме в процессе биосинтеза, и после секреции сквозь мембрану, и при сворачивании в пробирке (ренатурации), — чем бы и как бы она ни была в этой пробирке развернута]. С другой стороны, нет никаких гарантий, что эта структура — самая стабильная из всех возможных: у белковой цепи просто нет времени на то, чтобы убедиться в этом!»

Структура переходного состояния белка CheY

Клеточная машинерия, способствующая правильному сворачиванию белка
Шапероны
Пролилизомераза
Дисульфидизомераза

Шапероны
Бывают двух типов:
Фолдазы (GroEL/GroES, DnaK/DnaG)
Холдазы (HsP 33)
Примеры эукариотических шаперонов:
GRP78/BiP, GRP94, GRP170, кальнексин, кальретикулин, Hsp47
Примеры прокариотических шаперонов:
Hsp60, Hsp70, Hsp90, Hsp100

Механизм работы шаперона из класса фолдаз (на примере GroEL/GroES)

Механизм работы шаперона из класса холдаз (на примере DnaK)

Дифференциальная сканирующая калориметрия (устройство прибора)

Дифференциальная сканирующая калориметрия (принцип метода)
ΔH=∫ΔCp (T)dT
ΔS=∫ΔCp(T)/TdT
ΔCp= Mw x 0.06/ Cm x Vc x v

Кривые ДСК биомолекул зависят от:
рН
Скорости нагрева
Природы растворителя
Ионной силы раствора
Концентрации вещества

Критерий Вант-Гоффа
«Эффективная теплота" перехода, вычисляемая из его ширины совпадает с "калориметрической теплотой" этого перехода, т.е. с количеством тепла, поглощаемым одной молекулой белка в процессе плавления, следовательно, молекула плавится как единое целое.
Эффективная теплота перехода, следующая из его ширины, есть количество тепла, поглощенного одной независимой "единицей плавления". Если эффективная теплота перехода меньше калориметрической — "единица плавления" меньше, чем сама молекула, т.е. молекула плавится по частям. Если эффективная теплота перехода больше калориметрической — "единица плавления" больше молекулы, т.е. плавится не одна молекула белка, а какой-то их агрегат.
ΔE = 4κΤ02/ΔΤ.
Калориметрическая теплота плавления целого белка рассчитывается как ΔH/N, где ΔH количество тепла, поглощенного всеми имеющимися в калориметре N молекулами белка.
ΔE = ΔH/N

ΔHv-g= ΔHcal

Калориметрия мультидоменных белков

Определение стабильности белков с помощью ДСК

Что еще можно узнать из спектров ДСК белков?

Изотермическая калориметрия титрования (устройство прибора)

Изотермическая калориметрия титрования (принцип метода)
ΔG = -RTlnKa = ΔH-TΔS

Изотермическая калориметрия титрования. Приложения метода
Идентификация таргетного белка из смеси биомолекул
Из кривой связывания мы можем посчитать:
-константу связывания
-энтальпию
-энтропию
-стихиометрию реакции
-другие термодинамические характериситки

Изотермическая калориметрия титрования. Приложения метода
Идентификация таргетного белка из смеси биомолекул

Дифференциальный термический анализ