Кинетика сбалансированного роста клеточной популяции в целом

Если небольшое количество живых клеток поместить в раствор, содержащий все необходимые питательные вещества, то при определенных температуре и рН клетки будут расти.
В зависимости от морфологии клетки процесс ее роста может происходить двумя путями.
Одноклеточные организмы претерпевают в процессе роста деление, и поэтому увеличение их биомассы (массы живых организмов) сопровождается увеличением числа клеток.
Совершенно по-иному происходит рост плесневых грибов - в этом случае по мере роста организма возрастают в первую очередь длина и число гиф мицелия.
Таким образом, в культуре растущей плесени увеличиваются размеры организмов и их концентрация, но не обязательно число организмов.
2

С клеточным ростом тесно связаны два других процесса: поглощение клеткой некоторых веществ из окружения и выделение конечных продуктов метаболизма клетки в среду. В процессе роста скорости этих процессов изменяются в очень широких пределах.
Среди множества известных процессов с участием культур клеток достаточно часто встречается только ограниченное число типичных путей утилизации субстрата и образования продуктов жизнедеятельности клеток.
3

Популяция клеток
Анализ растущей популяции клеток в общем виде.
Основные параметры, явления и взаимодействия влияющие на кинетику роста популяции клеток
Среда (окружение)
Питательные вещества
Субстраты
Продукты метаболизма
Теплота
Механические воздействия
4

Во всех случаях нужно учитывать две взаимодействующие системы:
биологическую фазу, состоящую из популяции клеток,
и фазу, окружающую эту популяцию, или среду.
Клетки поглощают питательные вещества и превращают субстраты (взятые из среды) в продукты метаболизма.
Клетки генерируют теплоту, а температура среды в свою очередь определяет температуру клеток.
Среда оказывает механическое воздействие на клетки посредством гидростатического давления или гидродинамических эффектов, а также путем изменения вязкости среды вследствие накопления клеточной массы и продуктов жизнедеятельности клеток.
5

Среда должна быть многокомпонентной (содержать все необходимые для роста клеток питательные вещества).
В ней накапливаются (по мере роста клеток) различные конечные продукты клеточного метаболизма.
Химические реакции могут происходить и в среде, что приводит к модификации продуктов метаболизма.
Например, при гидролизе пенициллина.
Часто клетки потребляют или продуцируют вещества, изменяющие кислотность среды; взаимосвязь клеточных процессов с кислотно-основным равновесием определяет рН среды, который в свою очередь влияет на клеточную активность и на процессы транспорта.
В ходе клеточных реакций могут происходить изменения температуры, ионной силы, рН и реологических свойств бульона во времени.
6

Часто среда представляет собой многофазную систему, состоящую из жидкой фазы и диспергированных в ней пузырьков газа или из двух несмешивающихся жидких фаз, а иногда из одной газовой и двух жидких фаз.
К числу последних достижений в разработке биореакторов относятся методы одновременного проведения клеточных реакций и процессов разделения путем введения в среду особых веществ, способствующих образованию дополнительной жидкой или твердой фазы.
Наконец, в силу большого объема биологического реактора, высокой вязкости и неньютоновской природы бульона в отдельных его точках могут создаться разные условия.
Все эти параметры и переменные среды существенно влияют на кинетику клеточного роста.
7

Каждая индивидуальная клетка представляет собой сложную многокомпонентную систему, которая даже на клеточном уровне далека от гомогенности.
В каждой клетке одновременно осуществляется множество химических реакций, управляемых сложным комплексом систем регуляции.
Благодаря этим системам клетка может изменять (и изменяет на самом деле) скорость и даже тип происходящих в ней химических реакций в зависимости от условий и состава среды.
Длительное культивирование клеточной популяции может сопровождаться накоплением спонтанных мутаций; кроме того, особенности технологического процесса могут налагать давление отбора, приводящее к медленным изменениям генетической природы штамма.
8

С другой стороны, в культуре растущих клеток всегда наблюдается существенная гетерогенность популяции, т. е. в любой момент, в любом, даже самом малом объеме культуры индивидуальные клетки различаются по возрасту (одни только образовались в результате деления, другие уже достигли состояния зрелости, а третьи находятся в стадии деления) и, следовательно, по биохимической активности.
Очевидно, практически невозможно создать кинетическую модель, которая учитывала бы все параметры и факторы, перечисленные в таблице выше.
Поэтому рассмотрим ряд приближений, которые позволяют упростить эту картину и найти математические выражения, описывающие кинетику роста популяции клеток.
9

Что касается среды, то обычно допускают, что, за исключением одного компонента, все ее составляющие присутствуют в таких высоких концентрациях, что их изменения практически не отражаются на общих скоростях процессов.
Таким образом, один компонент среды становится питательным веществом, лимитирующим скорость клеточного роста, и при анализе влияния состава среды на кинетику роста клеток мы должны учитывать концентрацию только этого компонента.
Иногда возникает необходимость в учете некоторых других составляющих среды, например накапливающегося в среде ингибитора, в противном случае наше описание кинетики было бы слишком далеким от истинной картины.
10

В отношении других параметров среды часто можно допустить, что их изменения не влияют в сколько-нибудь существенной степени на кинетику роста микроорганизмов за тот период, в течение которого проводится типичный эксперимент или осуществляется типичный процесс, если эти изменения не превышают типичных для этого эксперимента или процесса пределов.
К тому же системы контроля и регулирования биореакторов могут поддерживать на постоянном уровне целый ряд параметров среды, в том числе рН, температуру и концентрацию растворенного кислорода.
Впрочем, в некоторых случаях для адекватного описания требуемого диапазона кинетического поведения может возникнуть необходимость учета в модели многокомпонентности и нескольких параметров среды.
11

На схеме 2 суммированы основные принципы различных приближений и способов описания, которые могут быть полезны при математическом анализе клеточной фазы системы.
Согласно этой схеме, разработанной Фредриксоном и Цучия, подходы к анализу микробиологических систем классифицируются в соответствии с числом компонентов, используемых при описании клеток, а также в зависимости от того, рассматриваются ли клетки как гетерогенная популяция различных объектов (как оно и есть на самом деле) или как популяция некоторых усредненных клеток (в этом случае клетки принципиально не отличаются от какого-либо компонента в растворе).
12

РЕАЛЬНАЯ СИТУАЦИЯ
МАКСИМАЛЬНО УПРОЩЕННЫЙ СПОСОБ
Приближение сбалансированного роста
Приближение «усредненной клетки»
Приближение сбалансированного роста
Приближение «усредненной клетки»
НЕСТРУКТУРИРОВАННЫЙ
СТРУКТУРИРОВАННЫЙ
НЕСЕГРЕГИРОВАННЫЙ
СЕГРЕГИРОВАННЫЙ
Схема 2 - Различные способы описания кинетики роста популяции клеток
13

Как показано на схеме 2 реальная ситуация отвечает структурированной сегрегированной системе.
Если гетерогенность клеток не влияет в существенной степени на кинетику исследуемых процессов, то можно принять «приближение усредненной клетки» и тем самым упростить способ описания от сегрегированного до не сегрегированного.
В так называемом состоянии «сбалансированного роста» вся синтетическая активность клеток скоординирована таким образом, что на средний состав клеток пролиферация популяции не влияет.
В этом случае допустимо использовать модели, не учитывающие многокомпонентную природу клеток.
Как мы видим ниже, при анализе и описании роста популяций клеток обычно принимают наиболее идеализированную ситуацию, т. е. несегрегированную, неструктурированную модель.
14

С другой стороны, мы познакомимся с рядом таких ситуаций, когда выгоднее рассматривать биологическую фазу как более сложную систему.
Так, в нестационарном состоянии (типичном, в частности, для периодических микробиологических процессов) условия сбалансированного роста даже в первом приближении соблюдаются только в течение сравнительно короткого промежутка времени.
Хорошо известно, что в ходе периодического процесса в очень широких пределах могут изменяться как клеточный состав популяции, так и скорости и типы реакций, осуществляющихся в этой популяции, и тогда могут пригодиться более детальные модели.
Кроме того, структурированные модели позволяют отражать непосредственно в математических выражениях известные особенности сети клеточных биохимических реакций.
15

Аналогично не представляющее особых затруднений включение в модель кинетики клеточного роста особенностей клеточного цикла (сегрегированный подход) способствует повышению ценности и расширению диапазона применимости модели.
Важнейшими элементами сегрегированных моделей являются кинетика и особенности регуляции роста индивидуальной клетки.
16

Живые клетки представляют собой чрезвычайно малые системы, поэтому количество любого химического компонента в них крайне ограничено.
Действительно величины очень малы по сравнению с обычным для химика числом молекул порядка 1023.
Предельным случаем является ДНК, которая в медленно растущей бактерии содержится только в количестве одной молекулы; очевидно, что в этом случае само понятие «концентрация ДНК в клетке» становится весьма неопределенным.
То же самое можно сказать о содержащихся в следовых количествах ионах, органоидах и многих других компонентах клетки.
Хотя в некоторых из рассмотренных ниже моделей мы будем описывать внутриклеточные события как непрерывные, следует отдавать себе отчет в том, что такое описание является всего лишь удобным приближением типичной усредненной клетки в популяции клеток.
17

18

19

Следовательно с возрастанием m неопределенность времени удвоения численности популяции быстро уменьшается.
Приняв, например, как и раньше, σ = 0,5 и t = 1,0, легко найти, что 95%-ные доверительные пределы для t в случае популяции из m клеток составляют
20

В сущности, этот несложный расчет еще раз подтверждает известное положение, что, как и в любых стохастических процессах при относительно большом числе событий (например, в химических реакциях или в явлениях, связанных с транспортом жидкостей), изменения характеристик популяции могут быть предсказаны с достаточно большой точностью, даже если стандартные отклонения характеристик индивидуальных клеток велики.
Так, рост инокулята, приводящий к повышению концентрации с 104 до 108 клеток в 1 мл, очевидно, обеспечивает достаточное усреднение по всем стадиям роста, что позволяет с высокой точностью определить время удвоения численности популяции.
Точно так же можно достаточно обоснованно говорить о скорости синтеза ДНК в типичной клетке популяции, хотя в каждой индивидуальной клетке синтезируется только одна или две молекулы ДНК со скоростью, которая в данный момент может резко отличаться от средней величины.
21

Невозможно обсуждать кинетику в отсутствие данных о конструкции реактора для измерения скоростей процессов и оценки их кинетики.
В следующем разделе мы вкратце рассмотрим соответствующие материальные балансы для двух типов идеальных биореакторов.
Затем мы приступим к анализу кинетики клеточного роста, начиная с ситуации, схематично изображенной в верхнем левом углу схемы 2, т. е. с простейших моделей кинетики клеточного роста, утилизации субстрата и образования продуктов метаболизма.
В последующих разделах главы мы изучим другие ситуации, также изображенные на схеме 2, и попытаемся оценить важность различных концептуальных и математических подходов к анализу кинетики роста популяции клеток.
22

.
В общем случае разработка кинетической модели популяции клеток является своего рода искусством, требующим,
во-первых, учета окончательной цели, для которой эта модель предназначается,
во-вторых, тщательно продуманного и обоснованного выбора основных переменных и параметров, влияющих на наиболее важные процессы, и,
в-третьих, известной концептуальной и математической гибкости, что необходимо для переводя качественных характеристик системы на язык применимых в практической деятельности математических выражений
23

КИНЕТИКА СБАЛАНСИРОВАННОГО РОСТА
Моделирование и анализ кинетики роста популяций клеток мы начнем с неструктурированных моделей, в которых биофаза характеризуется только величиной клеточной массы или численной концентрацией.
Суммарную скорость роста клеточной массы rx часто выражают как μχ, где χ – клеточная масса в единице объема культуры, а μ – удельная скорость роста клеток, выраженная в единицах обратного времени.
В этих параметрах уравнение материального баланса клеточной массы для ПРПП в стационарном состоянии будет выглядеть следующим образом: Dx1= (D-μ)x (4)
24

Часто поступающий в проточный реактор поток раствора питательных веществ состоит только из стерильного питательного вещества, так что χf = 0.
В таком случае следует, что отличная от нуля популяция клеток может существовать в стационарном состоянии только при D = μ (5)
Т. е. тогда, когда удельная скорость клеточного роста равна скорости разведения.
Если выполняется условие уравнения 4, то при стерильном питательном веществе уравнение 5 уже не определяет χ.
Неопределенность уровня популяции была подтверждена в экспериментах с культурой bacillus linens в проточном реакторе.
25