Лекция_3

Гормоны (от греч. hormao –
приводить в движение, возбуждать) – биологически активные вещества разной химической природы, образующиеся специализированными клетками желез внутренней секреции, которые выделяются непосредственно в кровь, лимфу и регулируют обмен веществ.

Гормональные препараты чаще классифицируются по химической структуре:
1. Гормоны белковой природы: простые (инсулин, пролактин, гормон роста) и сложные (фолатропин, лютропин, тиротропин) белки.
2. Гормоны пептидной природы: глюкоген, кальцитонин, соматостатин, вазопрессин, окситоцин.
3. Гормоны липойдной природы (стероидные гормоны): котикостероиды, андрогены, эстрогены, простагландины.
4. Парагормоны, тканевые гормоны: гастрин, секретин, гепарин.

Получают гормоны эндокринных желез:
путем химического синтеза;
методами генной инженерии;
выделением из сырья животного происхождения;
с помощью методики биотрансформации.

Получение инсулина
Инсулин – гормон поджелудочной железы, вырабатываемый β-клетками островков Лангерганса, играет важную роль в углеводном обмене.
Молекула инсулина, как
установил Сенгер, состоит
из двух полипептидных цепей
– А и В, соединенных двумя
дисульфидными связями.
А цепь состоит из 21,
а В-цепь – из 30
аминокислотных остатков.

Впервые инсулин удалось выделить из поджелудочных желез телят и сделать инъекцию человеку канадскому учёному Фредерику Батингу в 1921 году. Начиная с этого времени и до 80-х годов, было налажено производство инсулина из поджелудочных желез крупного рогатого скота и свиней.
Инсулин в кристаллическом виде впервые сумел получить в 1926 г. Дж.Абель. Именно благодаря его работам удалось наладить промышленное производство препарата. Абель также определил, что вещество представляет собой белковую молекулу.
В 1981 году впервые был создан человеческий инсулин способом генной инженерии, путём встраивания человеческого гена, отвечающего за выработку инсулина в ДНК дрожжевой бактерии.
В 1982 году человеческий инсулин был создан методом замены аминокислоты аланин на аминокислоту трионин.

Степени очистки:
традиционные — экстракция этанолом, а в процессе очистки фильтрация, высаливание и многократная кристаллизация (метод не позволяет очистить препарат от примесей других гормонов, содержащихся в поджелудочной железе)
монопиковые (MP) — после традиционной очистки фильтрация на геле (при проведении гельхроматографии образуют всего один «пик»: содержание вышеперечисленных примесей не более 1·10−3)
монокомпонентные (MC) —ещё более глубокая очистка с помощью молекулярного сита и метода ионообменной хроматографии на DEAE-целлюлозе, что позволяет добиться 99 % степени их чистоты (1·10−6)

Инсулин человека можно производить 4 способами:
полным химическим синтезом;
2) экстракцией из поджелудочных желез человека;
3) полусинтетическим методом с помощью ферментно-химической замены в положении 30 В-цепи аминокислоты аланина в свином инсулине на треонин;
4) биосинтетическим способом по генноинженерной технологии.

1 и 2 способы не подходят для производства из-за неэкономичности, недостаточной разработанности первого способа и недостатка сырья для массового производства вторым способом;
В настоящее время инсулин человека получают двумя способами: модификацией свиного инсулина синтетико-ферментативным методом(3) и генно-инженерным способом(4).
Данные методы позволяют получить человеческий инсулин высокой степени очистки.

Выделение инсулина из животного сырья
Стадии получения инсулина:
1) Измельчение замороженных поджелудочных желез.
2) Экстракция кислым спиртовым раствором.
3) Осаждение балластных белков.
4) Освобождение от липидов.
5) Десорбция инсулин.
6) Осаждение раствором цинка-ацетата (pH 6,2).
7) Очистка методом кристаллизации,
8) Очистка инсулина: осаждение, гель-фильтрации.
9) Перекристаллизация.
10) Сушка.

Модификация свиного инсулина
синтетико-ферментативным методом
Замена остатка аланина, в цепи В на остаток треонина достигается путем ферментативного замещения с последующей хроматографической очисткой продукта, в результате чего получается однокомпанентный инсулин человека, с 99% содержанием чистого препарата.

Получение генно-инженерного инсулина
Схема технологического процесса:
1.Получение посевного материала штамма-продуцента
1.1. Оживление консервированной культуры.
1.2. Выращивание маточной культуры.
1.3. Выращивание инокулята.
2. Биосинтез гибридного белка
2.1. Выращивание продуцента в ферментере (ферментация).
2.2. Получение биомассы (сепарирование).
2.3. Дезинтеграция клеточной суспензии.
2.4. Выделение и отмывка телец включения (центрифугирование).
3. Выделение и очистка рекомбинантного белка
3.1. Солюбилизация телец включения и восстановление рекомбинантного белка.
3.2. Ренатурация рекомбинантного белка.
3.3. Хроматографическая очистка рекомбинантного белка.
4. Ферментативное расщепление рекомбинантного белка
5. Хроматографическая очистка инсулина 1
6. Хроматографическая очистка инсулина 2
7. Хроматографическая очистка инсулина 3
8. Получение кристаллического инсулина

2.2. Получение биомассы (сепарирование).
2.3. Дезинтеграция клеточной суспензии.
2.4. Выделение и отмывка телец включения (центрифугирование).
3. Выделение и очистка рекомбинантного белка
3.1. Солюбилизация телец включения и восстановление рекомбинантного белка.
3.2. Ренатурация рекомбинантного белка.
3.3. Хроматографическая очистка рекомбинантного белка.
4. Ферментативное расщепление рекомбинантного белка
5. Хроматографическая очистка инсулина 1
6. Хроматографическая очистка инсулина 2
7. Хроматографическая очистка инсулина 3
8. Получение кристаллического инсулина
Конечные стадии получения генно-инженерного инсулина

Требования к качеству субстанции инсулина человека изложены в соответствующих разделах Американской Фармакопеи (Ф. США) и Европейской Фармакопеи (ЕФ).
Инсулин должен быть охарактеризован качественно.
Первый показатель определяется методом ВЭЖХ в сравнении со стандартом (сравнением хроматографических профилей инсулина и инсулина-стандарта, расщепленных специфическим ферментом на 4 фрагмента («метод пептидных карт»)) и определением биоидентичности (in vivo, на кроликах, по сравнительному содержанию глюкозы в крови).
Количественное определение проводится также методом обращенно-фазовой ВЭЖХ. Количество гормона принято оценивать в международных единицах (ME), при этом 1 ME (IU) = 0,0347 мг инсулина.