Молекулярная биология. Размножения растений. Лекция 1. Введение + методы

Содержание

Слайд 2

Что мы сегодня будем обсуждать?

Что является предметом изучения?
Почему это важно?
Кто и когда

Что мы сегодня будем обсуждать? Что является предметом изучения? Почему это важно?
впервые поставил вопрос и начал искать ответы?
Какая техника используется для исследования?
Как подготавливают материал для исследования?

Слайд 3

Размножение растений. О чём идёт речь?

Растения размножаются половым и бесполым путём: смена

Размножение растений. О чём идёт речь? Растения размножаются половым и бесполым путём:
поколений.
Растения также размножаются вегетативно (без смены поколений).

В нашем курсе речь пойдёт о половом/гаплоидном поколении растений: ♂ и ♀гаметофитах и их взаимодействии

Слайд 4

Почему важно изучать размножение растений?

Фундаментальный интерес
Практический интерес

Почему важно изучать размножение растений? Фундаментальный интерес Практический интерес

Слайд 5

Какая наука его изучает?

Размножение растений можно рассматривать с позиции ботаники (описание, видовая

Какая наука его изучает? Размножение растений можно рассматривать с позиции ботаники (описание,
специфичность) и физиологии (механизмы, процессы).
В настоящее время существует раздел ботаники «эмбриология растений», который изучает особенности размножения и раннего развития растений.
Мы будем придерживаться физиологического подхода.

Слайд 6

Как всё начиналось?

Теофраст – «отец ботаники» (прим. 370 - 288 до н.э.)

Как всё начиналось? Теофраст – «отец ботаники» (прим. 370 - 288 до
написал «Историю растений» и «Причины растений», в которых даются основы классификации и физиологии растений.
Он сразу обозначил ключевые физиологические вопросы, в том числе, об органах растений (включая генеративные) и их функциях, возможных механизмах зарождения/размножения растений и т.п.
Таким образом, ботаника на всех этапах развития включала в себя репродуктивную физиологию в той или иной форме

Слайд 7

Линней и размножение растений

Первая научная работа К.Линнея называлась «Введение в половую жизнь

Линней и размножение растений Первая научная работа К.Линнея называлась «Введение в половую
растений» («Введение к помолвкам растений») 1729 г.
В нём были изложены основные идеи его будущей половой классификации растений.
Рукопись представляла собой обзор мнений по вопросу пола у растений античных и современных авторов, а также описание функций различных частей цветка в соответствии с идеями Вайяна (о вспомогательной роли лепестков и основополагающая роль тычинок-«женихов» и пестиков-«невест»).

Слайд 8

История фитоэмбриологии

Что обеспечило развитие представлений о репродукции растений?
развитие микроскопической техники и

История фитоэмбриологии Что обеспечило развитие представлений о репродукции растений? развитие микроскопической техники

укоренение идей о «происхождении организма из зародыша», о необходимости мужского и женского начал

Слайд 9

Жан Батист Амичи первым наблюдал пыльцевую трубку (1823), «зародышевый пузырёк» (яйцеклетку) и

Жан Батист Амичи первым наблюдал пыльцевую трубку (1823), «зародышевый пузырёк» (яйцеклетку) и
высказал правильное предположение о развитии зародыша под влиянием оплодотворяющего начала, привнесённого пыльцевой трубкой (1843).
Однако, неясным оставалось 2 вопроса: (а) какой из элементов является мужским, а какой – женским, и (б) из какого элемента развивается зародыш?
Путаницу вносил Маттиас Шлейден, который настаивал на главенстве мужского начала (в соответствии с патриархальными устоями).

Слайд 10

Методы

Наблюдение и описание
Эксперимент
Моделирование

Методы Наблюдение и описание Эксперимент Моделирование

Слайд 11

Классическая световая микроскопия

Морфологические исследования на живых, но чаще фиксированных объектах
Фиксация обеспечивает стабильность

Классическая световая микроскопия Морфологические исследования на живых, но чаще фиксированных объектах Фиксация
проб и улучшала их оптические свойства.
Предел разрешающей способности: полупериод волны излучения. Диапазон длин волн 200—700 нм
→ можно различать структуры с расстоянием между точками до ~0,20 мкм → максимальное увеличение ~2000 Х

Слайд 12

Световая микроскопия. Работа с неокрашенными препаратами.

Классический фазовый контраст (тонкие прозрачные объекты)
дифференциальная интерференционно-контрастная

Световая микроскопия. Работа с неокрашенными препаратами. Классический фазовый контраст (тонкие прозрачные объекты)
микроскопия (DIC, Differential Interference Contrast или микроскопия Номарского) – подходит как для тонких, так и для более толстых объектов.
Принцип – разделение 2 лучей с их последующей интерференцией.

Слайд 13

DIC. Some more

Луч поляризуется.
Два луча идут параллельно.
За счет отклонения лучей в толще

DIC. Some more Луч поляризуется. Два луча идут параллельно. За счет отклонения
препарата от параллели создается эффект объемного изображения.

Слайд 14

Флуоресцентная микроскопия

Светят молекулы – флуорофоры
Яркое свечение на темном фоне обеспечивает повышение отношения

Флуоресцентная микроскопия Светят молекулы – флуорофоры Яркое свечение на темном фоне обеспечивает
сигнал/шум по сравнению с просветными красителями
Возможность компьютерного улучшения и анализа изображения
Возможность прижизненного наблюдения!

Автор: Henry Mühlpfordt Fluoreszenzmikroskopie_2008-09-28.svg:

Слайд 15

Флуоресцентная микроскопия

Широкопольная (флуоресценция возбуждается светом лампы с помощью набора фильтров)
Конфокальная лазерная сканирующая

Флуоресцентная микроскопия Широкопольная (флуоресценция возбуждается светом лампы с помощью набора фильтров) Конфокальная
(ф. возбуждается лазером, получается тонкий срез, возможно 3D реконструкция)

Слайд 16

Флуоресцентная микроскопия

Широкопольная vs конфокальная

Флуоресцентная микроскопия Широкопольная vs конфокальная

Слайд 17

Современные разновидности

Мультифотонная конфокальная микроскопия
Обеспечивает глубокое проникновение в толщу тканей
Позволяет получать 3D изображение

Современные разновидности Мультифотонная конфокальная микроскопия Обеспечивает глубокое проникновение в толщу тканей Позволяет

Позволяет работать с крупными объектами, например, с пестиками in vivo.
Меньше выцветания и токсичности для объекта
Требует инфракрасного лазера

Слайд 18

Современные разновидности

Микроскопия полного внутреннего отражения (TIRF, Total Internal Reflection Fluorescence)
Применяют для изучения

Современные разновидности Микроскопия полного внутреннего отражения (TIRF, Total Internal Reflection Fluorescence) Применяют
примембранного слоя клетки, контактирующей с покровным стеклом.
Толщина слоя, в котором возбуждается флуоресценция, составляет около 100 нм. Прекрасное разрешение по оси Z.
Меньше выцветания и стресса

Слайд 19

Современные разновидности

Восстановление флуоресценции после фотовыжигания FRAP (Fluorescence Recovery After Photobleaching)
Применяется для

Современные разновидности Восстановление флуоресценции после фотовыжигания FRAP (Fluorescence Recovery After Photobleaching) Применяется
исследования подвижности биоорганических молекул
Сфокусированный лазерный луч высокой интенсивности выжигает молекулы флуорофора в небольшой области клетки. После этого молекулы из необлученной зоны диффундируют в облученную, флуоресценция восстанавливается.
По скорости этого процесса можно судить о подвижности молекул.

Слайд 20

Микроскопия сверхвысокого разрешения

STED (Stimulated Emission Depletion microscopy)

Микроскопия сверхвысокого разрешения STED (Stimulated Emission Depletion microscopy)

Слайд 21

Микроскопия сверхвысокого разрешения

PALM (PhotoActivated Localization Microscopy)

Микроскопия сверхвысокого разрешения PALM (PhotoActivated Localization Microscopy)

Слайд 22

PALM. Some more

Разновидность широкополосной микроскопии
Метод года-2008 по версии Nature Methods
Основа метода –

PALM. Some more Разновидность широкополосной микроскопии Метод года-2008 по версии Nature Methods
возбуждение (активация) отдельных молекул флуорофора по очереди, с последующим выжиганием.
Две молекулы можно различить, потому что они светят не одновременно

Слайд 23

Подготовка проб для флуоресцентной микроскопии

В каких случаях мы можем увидеть флуоресценцию?
Автофлуоресценция
Красители
Антитела с

Подготовка проб для флуоресцентной микроскопии В каких случаях мы можем увидеть флуоресценцию?
флуоресцентной меткой
Флуоресцентные белки

Слайд 24

Автофлуоресценция

Автофлуоресценция свойственна многим растительным тканям.
Для репродуктивных структур наиболее важная автофлуоресценция - клеточной

Автофлуоресценция Автофлуоресценция свойственна многим растительным тканям. Для репродуктивных структур наиболее важная автофлуоресценция
оболочки
Как правило, в ультрафиолете светят фенольные соединения

Слайд 25

Флуоресцентные красители

Прижизненные и для фиксации
Красители для визуализации (качественные) и (полу)количественной оценки
Красители на

Флуоресцентные красители Прижизненные и для фиксации Красители для визуализации (качественные) и (полу)количественной
ядро (ДНК), митохондрии, Гольджи, цитоскелет
Красители на мембранный потенциал, АФК, внутриклеточные ионы, рН

Слайд 26

Увидеть органеллы

ДНК и митохондрии

ДНК, ядрышко и митохондрии

актиновые микрофиламенты

везикулы и митохондрии

митохондрии

Увидеть органеллы ДНК и митохондрии ДНК, ядрышко и митохондрии актиновые микрофиламенты везикулы и митохондрии митохондрии

Слайд 27

Полуколичественные и количественные красители

Активные формы кислорода: суммарные, перекись, супероксид-радикал

Целлюлоза

Внутриклеточный рН

Кальций

Мембранный потенциал

Полуколичественные и количественные красители Активные формы кислорода: суммарные, перекись, супероксид-радикал Целлюлоза Внутриклеточный рН Кальций Мембранный потенциал

Слайд 28

Иммунофлуоресценция

Первичная/прямая (метка на первичном антителе)
Вторичная/непрямая (метка на вторичном антителе)

Иммунофлуоресценция Первичная/прямая (метка на первичном антителе) Вторичная/непрямая (метка на вторичном антителе)

Слайд 29

Флуоресцентные белки

Самый совершенный метод на настоящий момент
Требует генетической кухни (трансформация)
Подходит для хорошо

Флуоресцентные белки Самый совершенный метод на настоящий момент Требует генетической кухни (трансформация)
изученных видов

Слайд 30

Так что же лучше?

Так что же лучше?

Слайд 31

Электронная микроскопия

Сканирующая

Трансмиссионная

Электронная микроскопия Сканирующая Трансмиссионная

Слайд 32

Иммуноцито/гисто/химия

С появлением совершенных методов флуоресцентной микроскопии метка на ТЭМ используется всё реже,

Иммуноцито/гисто/химия С появлением совершенных методов флуоресцентной микроскопии метка на ТЭМ используется всё
т.к. требует трудоёмкой пробоподготовки и трудна в интерпретации.
Но! ЭМ – это совсем другое разрешение

Слайд 33

Рентгеноспектральный микроанализ

РМА (Energy-dispersive X-ray spectroscopy) представляет собой гибрид ЭМ и элементного анализ.
Анализируется

Рентгеноспектральный микроанализ РМА (Energy-dispersive X-ray spectroscopy) представляет собой гибрид ЭМ и элементного
спектр, получаемый с выбранного участка препарата, который облучается мощным лучом.

Слайд 34

Correlative microscopy: два взгляда на один препарат

Correlative microscopy: два взгляда на один препарат

Слайд 35

Что мы можем увидеть? Всё!

Что мы можем увидеть? Всё!
Имя файла: Молекулярная-биология.-Размножения-растений.-Лекция-1.-Введение-+-методы.pptx
Количество просмотров: 40
Количество скачиваний: 0