Основы морфологии и методы изучения микроорганизмов

План занятия
1.Понятие о микроорганизмах. Бактерии: виды, строение бактериальной клетки.
2.Микроскопические методы изучения морфологии бактерий: виды микроскопов, методы окраски. Дифференциация бактерий по морфологическим и тинкториальным (окрашивания) свойствам.
3. Приготовление препаратов из разного нативного материала и культуры микроорганизмов, окраска простым и сложными методами, микроскопия в иммерсии, описание препарата. Правила техники безопасности при проведении микроскопических исследований.

Морфология бактерий
Подавляющее большинство бактерий (за исключением актиномицетов и нитчатых цианобактерий) одноклеточны и размножаются поперечным делением.
Бактерии имеют разнообразную форму и размеры. В природе наиболее широко распространены тонкостенные грамотрицательные и толстостенные грамположительные бактерии. Размеры бактерий варьируют в широких пределах.
1. Очень мелкие - до 0,1 мкм (микоплазмы, хламидии).
2. Мелкие - до 1,5 мкм (бруцеллы, стрептококки).
3. Средние - до 3,0 мкм (пастереллы, сальмонеллы).
4. Крупные - до 10,0 мкм (бациллы, клостридии).

Строение бактериальной клетки
Структурные компоненты бактериальной клетки делятся на обязательные (жизненно необходимые) и необязательные.

Строение бактериальной клетки
Обязательные структурные компоненты:
• (клеточная стенка);
• цитоплазматическая мембрана;
• цитоплазма;
• рибосомы;
• нуклеоид (ДНК).
Необязательные структурные компоненты:
• капсула;
• включения;
• жгутики;
• пили;
• плазмиды;
• споры.

Морфология бактерий, имеющих клеточную стенку

По внешнему виду среди бактерий различают шарообразные формы (кокки), извитые формы и палочки.

Кокки
-Монококки представляют собой одиночно расположенные шаровидные (кокковидные) бактерии,
-диплококки – соединенные вместе 2 бактерии, --
-стрептококки – цепочка шаровидных бактерий,
-тетракокки – 4 соединенные вместе шаровидные бактерии,
-стафилококки – шаровидные бактерии, соединенные в виде грозди винограда,
-сарцины – кокки, уложенные в виде квадратных тюков.

Палочки
Палочковидные формы представлены бактериями, не образующими спор; а также спорообразующими бациллами – аэробными бактериями, образующими споры, диаметр которых равен толщине бактерии; и клостридиями – анаэробными бактериями, образующими споры, диаметр которых больше толщины бактерий.

Извитые формы
Извитые формы представлены вибрионами – изогнутыми бактериями; спириллами – спиралевидными бактериями; спирохетами – бактериями, изогнутыми и закрученными в виде локона.
Патогенные для человека спирохеты представлены 3 родами: Treponema, Borrelia, Leptospira. Трепонемы имеют вид тонких нитей, штопорообразно закрученных, количество завитков 8-12 (например, Treponema pallidum – возбудитель сифилиса). Боррелии имеют по 3-8 крупных завитков (например, возбудители болезни Лайма – Borrelia burgdorferi и возвратного тифа – B.recurrentis). Лептоспиры образуют 15-30 мелких завитков, завитки неглубокие и частые, концы лептоспир изогнуты наподобие крючков с утолщениями на концах в виде букв S или С (Leptospira interrogans - возбудитель лептоспироза).

Форма микроорганизмов не является основным признаком, т.к. среди бактерий, имеющих одни и те же морфологические свойства, встречаются различные патогенные и сапрофитные виды, относящиеся к разным семействам и родам.
Однако у некоторых бактерий имеются морфологические особенности, позволяющие провести первичную их идентификацию.
Bacillus anthracis (бацилла сибирской язвы) –клетки с прямыми обрубленными концами
Neisseria gonorrhoeae
(гонококк) –незавершённый
фагоцитоз, диплококки
внутри лейкоцита

Строение бактериальной клетки. КС
Функции клеточной стенки :
1. Является осмотическим барьером;
2. Определяет форму бактериальной клетки;
3. Защищает клетку от воздействий окружающей среды;
4. Несет разнообразные рецепторы, способствующие прикреплению бактериофагов, антител, а также различных химических соединений;
5. Через клеточную стенку в клетку поступают питательные вещества и выделяются продукты обмена;

Строение клеточной стенки бактерий.
У бактерий имеется 2 типа строения клеточной стенки. В обоих случаях ее основу составляет пептидогликан (муреин).

Строение клеточной стенки бактерий
У Гр+ бактерий муреин составляет до 90 % массы клеточной стенки и образует многослойный (до 20-30 слоев) каркас. Такие бактерии при окраске по методу Грама прочно удерживают комплекс генцианвиолет в комплексе с йодом, (сине-фиолетовый цвет) и называются грамполо-жительными Гр+.
У Гр- бактерий поверх слоев муреина располагается слой липополисахаридов. Эти бактерии при окраске по методу Грама не способны прочно удерживать комплекс генцианового фиолетового и йода и, соответственно, обесцвечиваются спиртом, прокрашиваясь дополнительным красителем - фуксином в розово-красный цвет. Они называются грамотрицательными Гр-

Схема окрашивания по Граму
1. Кристалвиолет (генцианвиолет) 2-3 мин.
2. Раствор Люголя (раствор I2 в KI) на 1 мин.
3. 95% этиловый спирт - несколько раз до тех пор, пока не перестанут отходить фиолетовые струйки красителя.
4. Вода
5. Фуксина Циля 1-2 мин

Строение цитоплазматической мембраны
К клеточной стенке бактерий примыкает цитоплазматическая мембрана, строение которой аналогично мембранам эукариотов (состоит из двойного слоя липидов, главным образом фосфолипидов, со встроенными поверхностными и интегральными белками).

Строение цитоплазматической мембраны
Функции ЦПМ
Цитоплазматическая мембрана (ЦПМ) обеспечивает:
1. Избирательную проницаемость и транспорт веществ в клетку;
2. Транспорт электронов и (синтез АТФ);
3. Выделение гидролитических экзоферментов;
4. Биосинтез различных полимеров.
ЦПМ отделяет цитоплазму от клеточной стенки, служит осмотическим барьером клетки, регулирует транспорт веществ. Нередко она образует впячивания - мезосомы.
С ЦПМ и её производными связан также биосинтез клеточной стенки и спорообразование. К ней прикреплены жгутики, геномная (хромосомная) ДНК.
В цитоплазме локализованы рибосомы и бактериальный нуклеоид, в ней также могут находиться включения и плазмиды (внехромосомная ДНК).

Строение бактериальной клетки.

Строение бактериальной клетки. Спора
Споры бактерий представляют собой форму существования бактериальных клеток в состоянии анабиоза и образуются при неблагоприятных условиях внешней среды.
Споры располагаются внутри бактериальной клетки терминально, субтерминально, центрально, иногда латерально.
Расположение спор:
1, 4 – центральное; 2, 3, 5 – терминальное; 6 – латеральное;
7 – субтерминальное

Строение бактериальной клетки. Спора
В процессе спорообразования бактериальная клетка почти полностью теряет воду, сморщивается, клеточная стенка уплотняется. Появляется новое вещество - дипиколинат кальция, которое образует комплексы с биополимерами клетки, устойчивые к действию температуры и ультрафиолетовых лучей.
Бактерии в споровой форме не размножаются. Споры образуют только Гр+ бактерии.

Строение бактериальной клетки. Жгутики
Основная функция жгутиков - движение.
Характеристика жгутиков:
•органоиды движения (скользящее, плавающее) бактерий;
•белковая природа (сократительный белок флагеллин –похож на миозин);
•тонкие, длинные;
•состоят из спирально закрученной
нити, крюка и базального тельца
(базальной структуры).

Строение бактериальной клетки. Жгутики
В зависимости от количества и расположения жгутиков бактерии подразделяются на 4 группы:
1. Монотрихи - имеют только один жгутик (род Vibrio),
2. Лофотрихи - пучок жгутиков на одном полюсе клетки (род Pseudomonas)
3. Амфитрихи - жгутики (один или пучок) расположены на обоих полюсах клетки (род Spirillum),
4. Перитрихи - жгутики расположены по всей поверхности клетки (род Escherichia, Salmonella).
монотрих лофотрих амфитрих перитрих

Строение бактериальной клетки. Пили
На поверхности ряда бактерий существуют белковые образования – пили (ворсинки ,фимбрии, микроворсинки).
Функции пилей:
• слипание бактерий между собой;
• прикрепление бактерий к поверхностям;
• адгезия (прилипание к эукариотам);
• транспорт метаболитов;
• половые пили для конъюгации.

Строение бактериальной клетки. Генетический материал.
НУКЛЕОИД - одна замкнутая кольцевидная хромосома, содержащая до 4000 отдельных генов, необходимых для поддержания жизнедеятельности и размножения бактерий, бактериальная клетка гаплоидна.

Строение бактериальной клетки. Генетический материал.
Плазмиды образованы молекулами ДНК.
Регуляторные плазмиды участвуют в компенсировании тех или иных дефектов метаболизма бактериальной клетки.
Кодирующие плазмиды привносят в бактериальную клетку новую генетическую информацию, кодирующую новые, необычные свойства (например, устойчивость к антибиотикам)

Строение бактериальной клетки. Генетический материал.
Плазмиды
F-плазмиды контролируют синтез F-пилей, способствующих передаче генетического материала от бактерий-доноров (F+) к бактериям-реципиентам (F–) в процессе конъюгации
R-плазмиды (от англ. resistance, устойчивость) кодируют устойчивость к лекарственным препаратам.
Плазмиды патогенности контролируют вирулентные свойства бактерий и токсинообразование (плазмиды включают tox+-гены).
Плазмиды бактериоциногении кодируют синтез бактериоцинов - белковых продуктов, вызывающих гибель бактерий того же или близких видов. Плазмиды могут кодировать устойчивость к антибиотикам.

Микроскопические методы изучения морфологии бактерий.
Микроскопия:
- световая (просвечивающая, фазово-контрастная, темно-польная)
-электронная
-люминесцентная

Микроскопические методы изучения морфологии бактерий.
Микроскопический метод
исследования
это изучение под
микроскопом
окрашенных
препаратов из
исследуемого
материала:
Достоинства:
-быстрый;
-ранний.
Недостатки:
-неточный
(ориентировочный)

Микроскопические методы изучения морфологии бактерий.
Для увеличения:
- объективы:
малый х8
большой х40
иммерсионный х90
- окуляры:
х7, х10, х15 раз

Микроскопические методы изучения морфологии бактерий.
Общее увеличение микроскопа равно произведению увеличения объектива на увеличение окуляра (например, 10х40=400).
Разрешающая способность микроскопа – это размер наименьшего объекта, который можно увидеть в данный микроскоп.
Для световых микроскопов разрешающая способность – 0,2 мкм, для электронного - в 100-1000 раз выше.

Микроскопические методы изучения морфологии бактерий иммерсионная
Иммер-
сионная
Сухая

Микроскопические методы изучения морфологии бактерий
Преимущества иммерсионной системы
Большее увеличение (увеличивает в 90 раз вместо 40 в сухой системе микроскопии)
2. Лучшая освещенность за счет создания однородной среды для прохождения лучей света с помощью иммерсионного масла

Микроскопические методы изучения морфологии бактерий
Правила работы с микроскопом при использовании иммерсионной системы:
1. Настроить освещение микроскопа, используя вогнутое зеркало и объектив.
2. На приготовленный и окрашенный мазок на предметном стекле нанести каплю иммерсионного масла и поместить его на предметный столик, укрепив зажимами.
3. Повернуть револьвер до отметки иммерсионного объектива 90 х.
4. Осторожно погрузить объектив в каплю масла под углом бокового зрения.
5. Установить ориентировочный фокус при помощи макровинта.
6. Провести окончательную фокусировку препарата микровинтом, вращая его в пределах только одного оборота. Нельзя допускать соприкосновения объектива с препаратом, так как это может повлечь поломку покровного стекла или фронтальной линзы (свободное расстояние иммерсионного объектива 0,1-1мм).
7. По окончании работы микроскопа необходимо вытереть масло с иммерсионного объектива и перевести револьвер на малый объектив 8х.

Препараты для микроскопии
Препараты бывают двух типов:
1.Нативные (живые, препараты живых клеток).Долго не хранятся, основное назначение –определение подвижности клеток.
2.Фиксированные окрашенные. Хранятся долго, безопасны в использовании, на них видны морфологические особенности клеток.

Приготовление препаратов.
Окрашенные препараты. Методы окраски.
В микробиологии чаще всего используют основные красители (основной фуксин, метиленовая синь)

Техника приготовления фиксированных окрашенных препаратов