ПЦР как основа геномных методик. Занятие №2

Полимеразная цепная реакция (ПЦР)
Метод, позволяющий избирательно синтезировать большие количества определённых фрагментов ДНК.
Разработан Кэри Муллисом в 1983 году (Нобелевская премия 1993 года)
“Полимеразная” – используется фермент ДНК-полимераза
“Цепная” – состоит из повторяющихся циклов, количество ДНК с каждым циклом увеличивается в геометрической прогрессии

Виды ПЦР
1. В зависимости от измерения количества ПЦР-продукта:
качественная
количественная
2. Тип детекции ПЦР-продукта:
электрофоретическая
флюориметрическая
3. Этап детекции:
в конечной точке
в реальном времени

Применение ПЦР
I. Получение информации
генотипирование
ДНК-диагностика
анализ уровня транскрипции
II. Получение материала (накопление)
клонирование
мутагенез
секвенирование

Компоненты ПЦР-реакции

Состав реакционной смеси ПЦР
VРС = 10-50 мкл
ДНК 1-20 пг/мкл (плазмиды, фаги) или 2-20 нг/мкл (геном)
дНТФ 0,2 мМ
праймеры 0,2-1 мкМ
полимераза 0,01-0,05 е.а./мкл

Этапы ПЦР

Наиболее применяемые ДНК-полимеразы

Денатурация (denaturation)
Необходима для разрушения водородных связей между комплементарными цепями ДНК (плавление ДНК)
1. Температура (Td): определяется свойствами полимеразы, обычно составляет 95ºC. Для более термоустойчивых полимераз (Pwo) температура может быть увеличена.
2. Время: для крупных молекул (геномы) увеличивается, для малых (ампликоны) – уменьшается; время нужно также увеличивать в случае GC%>50%.

Отжиг (annealing)
На этом этапе происходит понижение температуры, и праймеры могут присоединиться к комплементарным участкам на матрице ДНК
Температура (Ta): зависит от состава праймеров, который определяет температуру плавления (melting) комплекса праймер–матрица (Ta = Tm - 5ºC).

Критерии подбора праймеров
1. GC-состав должен быть в пределах 40-60%. При этом G/C должны быть распределены равномерно (не образовывать кластеров).
2. Температура плавления у прямого и обратного праймера должна отличаться не более, чем на 5ºC.
3. Должны отсутствовать самокомплементарные участки как внутри праймера (иначе могут образовываться шпильки), так и между праймерами (иначе образуются димеры праймеров).
4. Лучше, если на 3'-конце праймеров будут G/C (связь сильнее), но не более 3х (чтобы не было отжига на неспецифические участки).

Температура плавления праймеров
Tm=4*[n(G)+n(C)]+2*[n(A)+n(T)]
где n(X) - количество нуклеотида X в праймере

Элонгация
На этапе элонгации происходит синтез цепей ДНК с помощью ДНК-полимеразы.
1. Температура: определяется свойствами используемой ДНК-полимеразы и лежит в области оптимума для этого фермента (для Taq – 72ºC).
2. Время: рассчитывают по одной минуте на каждую т.п.н. ампликона (для небольших молекул обычно берут 0,5 мин.).

Онлайн-ресурсы для подбора условий ПЦР
Хранилище нуклеотидных последовательностей генов:
National Center for Bioinformatics (ncbi.nlm.nih.gov/gene)
Подбор праймеров:
Primer3 (bioinfo.ut.ee/primer3/)
Primer-BLAST (ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/)
Проведение расчётов (концентрации, операции с нуклеотидными последовательностями) и мн. др.:
MOLBIOL (molbiol.ru/scripts)

Домашнее задание №1: подбор праймеров.
1. Найти на NCBI в базе данных Gene запись о каком-нибудь гене, открыть её.

2. Открыть последовательность гена в формате FASTA.

3. В последовательности выбрать первые 1000 нуклеотидов и сохранить в текстовый файл.

4. “Наивный” подбор праймеров: с помощью сайта Molbiol составить праймеры (по 20 нуклеотидов) (прямой праймер совпадает с началом последовательности, обратный – комплементарен перевёрнутому концу последовательности)

5. Подбор “оптимальных” праймеров: скопировать последовательность и вставить в окошко на сайте Primer3; установить длину амплифицируемого фрагмента 900-1000, нажать Pick primers.

6. Выписать в файл с исходной последовательностью наиболее оптимальные праймеры (прямой и обратный), их температуры плавления и последовательность ПЦР-продукта (указать его длину).

7. Проверка качества “наивных” праймеров: вставить последовательности “своих” праймеров и нажать Pick primers; в файле указать характеристики праймеров и причины, по которым они не подходят (указаны в отчёте программы).