Разделение и очистка биомолекул

II Детекция и идентификация биомолекул
Гибридизация нуклеиновых кислот
Экспериментальные методы детекции и идентификации нуклеиновых кислот основаны на явлении их гибридизации, которое заключается в способности одноцепочечных молекул нуклеиновых кислот связываться с комплементарными по составу нуклеотидов одноцепочечными молекулами, образуя дуплексы (двухцепочечные молекулы нуклеиновых кислот).

Структура нуклеиновых кислот

Денатурация (плавление) ДНК
Денатурация ДНК обратима. Процесс восстановления структуры дуплекса ДНК называется ренатурацией или отжигом

Гибридизация НК
Дуплексы могут образовываться между одноцепочечными комплементарными по составу молекулами ДНК, РНК, олигонуклеотидами

Стабильность дуплексов нуклеиновых кислот определяется следующими факторами:
длина цепей − длинные дуплексы удерживаются большим числом водородных связей и требуют больше энергии для их разрушения;
- состав нуклеотидов − так как GC-пары образуют три водородные связи, а AT-пары − две, чем выше процентное содержание GC-нуклеотидов в составе цепей дуплекса, тем выше температура или рН среды, при которых происходит денатурация дуплекса;
- состав среды − моновалентные катионы (например, ионы Na+) стабилизируют структуру дуплекса; а вещества, разрушающие водородные связи, такие как мочевина и формамид, облегчают денатурацию
Стабильность дуплексов нуклеиновых кислот

Мерой стабильности дуплекса нуклеиновых кислот является температура плавления (Tm). Это температура, соответствующая средней точке перехода между исходным (двухцепочечным) и денатурированным (одноцепочечным) состоянием молекул нуклеиновых кислот.
Температуру плавления (Tm) дуплексов нуклеиновых кислот, в составе которых две цепи полностью комплементарны друг другу по составу нуклеотидов, можно рассчитать с помощью формул. Наличие некомплементарных оснований в цепях гетеродуплекса снижает его стабильность.
Примечания: а или для других моновалентных катионов, выполняется в диапазоне концентраций ионов 0,01- 0,4 М;
б справедливо при содержании GC пар от 30% до 70%;
в N – длина гетеродуплекса в п.н.
Стабильность дуплексов нуклеиновых кислот

Метод гибридизации нуклеиновых кислот

Детекция формирования гибридных дуплексов НК
Прямые методы детекции
Радиоактивные метки
Флуоресцентные метки

Флуорофоры, используемые для мечения нуклеиновых кислот

Непрямые методы детекции
Детекция формирования гибридных дуплексов НК
Репортерные молекулы
биотин
биотин – авидин - фермент

Метод гибридизации нуклеиновых кислот

Метод гибридизации in situ с применением флуоресцентных ДНК-зондов (fluorescence in situ hybridization, FISH)

Исследование активности генов
мРНК эукариот содержит на 3’-конце поли-А хвост.
Суммарную мРНК клетки можно выделить методом аффинной хроматографии, используя носитель с последовательностью поли-Т

Исследование активности генов
ДНК-микроматрицы и ДНК-биочипы

Исследование активности генов

Саузерн-блоттинг

Саузерн-блоттинг

Саузерн-блоттинг

Саузерн-блоттинг