Стратегии секвенирования кластеров ДНК в секвенаторах второго поколения

Содержание

Слайд 4

Стратегии секвенирования кластеров ДНК в секвенаторах второго поколения

2. Секвенирование синтезом (sequencing by

Стратегии секвенирования кластеров ДНК в секвенаторах второго поколения 2. Секвенирование синтезом (sequencing
synthesis –SBS)

Включение флуоресцентного терминатора
Считывание
Деблокирование и удаление флуорофора

Слайд 5

Структура некоторых обратимых терминаторов синтеза ДНК

Обратимая блокировка 3’-ОН группы

3’-O-Аллил

3’-O-Азидометил

Включаются в ДНК

Структура некоторых обратимых терминаторов синтеза ДНК Обратимая блокировка 3’-ОН группы 3’-O-Аллил 3’-O-Азидометил
только мутантными ДНК-полимеразами

Слайд 6

Извлечение информации из неупорядоченных микроматриц при секвенировании ДНК

Циклы:

1 2 3 4 5

Извлечение информации из неупорядоченных микроматриц при секвенировании ДНК Циклы: 1 2 3
6

C A T C G T

Циклы:

1 2 3 4

Каждый dNTP мечен своим флуорофором

5 6 7 8

Циклы:

Все dNTPs мечены одним флуорофором
В каждом цикле добавляют только один dNTP

Последовательности, верхний ряд: CTAGTG, нижний ряд: CAGCTA

Слайд 7

Проточная ячейка Полонатора и схема получения изображений

Снимок 436

Снимок 217

Снимок 1

Снимок 0

Снимок
2179

Снимок

Проточная ячейка Полонатора и схема получения изображений Снимок 436 Снимок 217 Снимок
217

Снимок
1962

Снимки 320х320мкм

Слив

Канал 0

Канал 7

Вход реагентов

Покровное стекло

Выход реагентов

Слайд 8

Секвенирование лигированием (1)

Секвенирование лигированием (1)

Слайд 9

Секвенирование лигированием (2)

Секвенирование лигированием (2)

Слайд 10

Секвенатор третьего поколения фирмы Pacific Biosciences

Секвенатор третьего поколения фирмы Pacific Biosciences

Слайд 11

Производные нуклеотидов для измерения флуоресценции в реальном времени

Включение нуклеотида в ДНК сопровождается

Производные нуклеотидов для измерения флуоресценции в реальном времени Включение нуклеотида в ДНК сопровождается освобождением флуорофора
освобождением флуорофора

Слайд 12

Строение и принцип действия SMRT-чипа (Single Molecule Real Time Sequencing-chip)

Диаметр отверстия каждого

Строение и принцип действия SMRT-чипа (Single Molecule Real Time Sequencing-chip) Диаметр отверстия
волновода (50 нм) в SMRT-чипе значительно меньше длины волны видимого света, поэтому свет проникает вглубь лишь на небольшое расстояние

SMRT-чип
43,5 х 32,8 мкм

Источник света

Подложка из стекла

Металл
100 нм

ZMW- волновод

Слайд 13

Схема синтеза ДНК в ZMW-волноводе

Возбуждение

Эмиссия

Меченые dNTPs

Включившийся dNTP

Одна молекула ДНК-полимеразы иммобилизована на дне

Схема синтеза ДНК в ZMW-волноводе Возбуждение Эмиссия Меченые dNTPs Включившийся dNTP Одна
каждого волновода

Слайд 14

Процесс секвенирования ДНК на SMRT-чипе

Включающийся в ДНК меченый нуклеотид задерживается в объеме

Процесс секвенирования ДНК на SMRT-чипе Включающийся в ДНК меченый нуклеотид задерживается в
считывания флуоресценции в течение миллисекунд, свободно диффундирующий нуклеотид – в течение наносекунд.
Включение обнаруживается в виде вспышки света определенной длины волны, характерной для конкретного нуклеотида..

Слайд 15

Секвенирование ДНК с помощью нанопор

Уникальная последовательность Гомополимер

Часть мембраны с нанопорой, через которую

Секвенирование ДНК с помощью нанопор Уникальная последовательность Гомополимер Часть мембраны с нанопорой,
проходит одноцепочечная ДНК

Изменения силы тока, проходящего через мембрану, под действием отдельных нуклеотидов ДНК

Молекула ДНК

Нанопора

Мембрана

Время, сек

пикоАмперы

Открытая пора

Слайд 16

Профиль изменений силы электрического тока во времени при секвенировании ДНК с использованием

Профиль изменений силы электрического тока во времени при секвенировании ДНК с использованием
нанопор

Время

Гипотетическая последовательность

pA. пикоамперы

Слайд 17

Секвенатор третьего поколения фирмы Oxford Nanopore Technologies (2012 г)

Производительность 1 млрд нуклеотидов

Секвенатор третьего поколения фирмы Oxford Nanopore Technologies (2012 г) Производительность 1 млрд
за 6 часов
Десятки тысяч нуклеотидов/1 прогон
Компьютер – ноутбук с USB-разъемом
Стоимость ~$900

Дэвид Димер (David Deamer) -
Предложил принцип метода секвенирования через нанопоры в 1989 году

Имя файла: Стратегии-секвенирования-кластеров-ДНК-в-секвенаторах-второго-поколения.pptx
Количество просмотров: 54
Количество скачиваний: 0