Стратегии секвенирования кластеров ДНК в секвенаторах второго поколения

Стратегии секвенирования кластеров ДНК в секвенаторах второго поколения
2. Секвенирование синтезом (sequencing by synthesis –SBS)
Включение флуоресцентного терминатора
Считывание
Деблокирование и удаление флуорофора

Структура некоторых обратимых терминаторов синтеза ДНК
Обратимая блокировка 3’-ОН группы
3’-O-Аллил
3’-O-Азидометил
Включаются в ДНК только мутантными ДНК-полимеразами

Извлечение информации из неупорядоченных микроматриц при секвенировании ДНК
Циклы:
1 2 3 4 5 6
C A T C G T
Циклы:
1 2 3 4
Каждый dNTP мечен своим флуорофором
5 6 7 8
Циклы:
Все dNTPs мечены одним флуорофором
В каждом цикле добавляют только один dNTP
Последовательности, верхний ряд: CTAGTG, нижний ряд: CAGCTA

Проточная ячейка Полонатора
и схема получения изображений
Снимок 436
Снимок 217
Снимок 1
Снимок 0
Снимок
2179
Снимок 217
Снимок
1962
Снимки 320х320мкм
Слив
Канал 0
Канал 7
Вход реагентов
Покровное стекло
Выход реагентов

Секвенирование лигированием (1)

Секвенирование лигированием (2)

Секвенатор третьего поколения фирмы Pacific Biosciences

Производные нуклеотидов для измерения флуоресценции в реальном времени
Включение нуклеотида в ДНК сопровождается освобождением флуорофора

Строение и принцип действия SMRT-чипа (Single Molecule Real Time Sequencing-chip)
Диаметр отверстия каждого волновода (50 нм) в SMRT-чипе значительно меньше длины волны видимого света, поэтому свет проникает вглубь лишь на небольшое расстояние
SMRT-чип
43,5 х 32,8 мкм
Источник света
Подложка из стекла
Металл
100 нм
ZMW- волновод

Схема синтеза ДНК в ZMW-волноводе
Возбуждение
Эмиссия
Меченые dNTPs
Включившийся dNTP
Одна молекула ДНК-полимеразы иммобилизована на дне каждого волновода

Процесс секвенирования ДНК на SMRT-чипе
Включающийся в ДНК меченый нуклеотид задерживается в объеме считывания флуоресценции в течение миллисекунд, свободно диффундирующий нуклеотид – в течение наносекунд.
Включение обнаруживается в виде вспышки света определенной длины волны, характерной для конкретного нуклеотида..

Секвенирование ДНК с помощью нанопор
Уникальная последовательность Гомополимер
Часть мембраны с нанопорой, через которую проходит одноцепочечная ДНК
Изменения силы тока, проходящего через мембрану, под действием отдельных нуклеотидов ДНК
Молекула ДНК
Нанопора
Мембрана
Время, сек
пикоАмперы
Открытая пора

Профиль изменений силы электрического тока во времени при секвенировании ДНК с использованием нанопор
Время
Гипотетическая последовательность
pA. пикоамперы

Секвенатор третьего поколения
фирмы Oxford Nanopore Technologies (2012 г)
Производительность 1 млрд нуклеотидов за 6 часов
Десятки тысяч нуклеотидов/1 прогон
Компьютер – ноутбук с USB-разъемом
Стоимость ~$900
Дэвид Димер (David Deamer) -
Предложил принцип метода секвенирования через нанопоры в 1989 году