Трансгенные растения

Что нужно, чтобы получить трансгенное растение?

Чужеродная ДНК должна проникнуть в клетку
«Избавление» от клеточной стенки

Бомбардировка клеток

Использование потенциала фитопатогенов

Встроился в геном
Экспрессировался (чтобы генетическая информация считывалась)
Нужно чтобы целевой участок ДНК:

Чужеродные гены находятся в составе векторных плазмид

Введение векторных конструкций в клетки растений
Станет ли после этого растение трансгенным?

Регенерация целых растений из отдельных трансформированных клеток

Основной подход для создания трансгенных растений

Корончатые галлы

Корончатые галлы

Agrobacterium tumifaciens

Agrobacterium tumifaciens

Интеграция тДНК в геном растения

Модификация Ti – плазмиды для создания трансгенных растений

Ген, который хотят встроить
Селективный маркер
Модификация Ti – плазмиды для создания трансгенных растений

Бинарный вектор

Введение векторных конструкций в клетки растений

Регенерация целых растений из отдельных трансформированных клеток

Ген, который хотят встроить
Селективный маркер
Модификация Ti – плазмиды для создания трансгенных растений

Откуда берут целевой фрагмент ДНК, который хотят встроить в растительный геном?

ПЦР (полимеразная цепная реакция) – метод селективной амплификации участка ДНК in vitro

Компоненты реакции:
Вода
Буфер для фермента (Taq- полимеразы)
Дезоксинуклеотид фосфаты
Праймеры (прямой и обратный)
Фермент (Taq-полимераза)
ДНК-матрица

Конструирование праймеров

Характеристики праймеров
Комплементарность мишени
Высокое GC содержание
На 3’-конце праймера G или С
Температура отжига 55-60° С
Отсутствие вторичных структур (шпилек и димеров)

BLAST

Что обычно используется в качестве матрицы (основы) для амплификации «нужного» участка ДНК?

Мы провели ПЦР, чтобы получить целевой фрагмент ДНК
Нужно выяснить получился ли у нас ожидаемый продукт
Электрофорез

Электрофоретическое разделение нуклеиновых кислот

Электрофорез ДНК в агарозном геле

Электрофорез белков

Разделение молекул в электрическом поле

Разделение макромолекул в зависимости от:
размера,
пространственной конфигурации,
электрического заряда

Разделение проводят в полиакриламидном геле
Акриламид
(СН2 = СН — CONH2)
NN'-Метиленбисакриламид
(CH2 = CH — CONH)2 – СН2
Буферные растворы

Индукция полимеризации акриламида
Персульфат аммония

Полимеризация акриламида

Тетраметилэтилендиамин (ТЕМЕД) — (СН3)2N — CH2 — CH2 — N(СН3)2
Катализатор процесса полимеризации

Денатурация белка с помощью ДДС

Высокая напряженность
Низкая напряженность
Подвижность ионов
Постоянная сила тока
Заряд ионов
Изоэлектрическая точка

А
Б
Глицин – малоподвижный ион. Высокое сопротивление. Высокая напряженность
Хлор – подвижный ион. Низкое сопротивление. Низкая напряженность
Одинаковая сила тока
Суммарное напряжение распределится между участками А и Б так, что напряженность поля А будет выше, причем настолько, чтобы скорость миграции ионов глицина стала точно такой же как у ионов хлора. Этого требует условие неизменности величины тока вдоль всего геля (постоянство тока во всем геле).

Двумерный электрофорез белков

Векторные конструкции

Рестриктазы

Сборка плазмиды. Рестрикция-лигирование.

Векторы для клонирования
X-Gal

Векторы для экспрессии

Лизис клеток

Очистка целевого белка
Хроматография

Векторы для трансформации растений

Определение первичной структуры ДНК

TACGATG
ATGCTAC
ATGCTAC
ATGCTAC
ATGCTAC
ATGCTAC
ATGCTAC
ATGCTAC