Транскрипция - биосинтез РНК на матрице ДНК

Транскрипция - биосинтез РНК на матрице ДНК
Последовательность рибонуклеотидов в молекуле РНК комплементарна последовательности дезоксирибонуклеотидов одной из цепи ДНК.
Цепь ДНК, по которой непосредственно идет транскрипция РНК-молекул, называется кодирующей цепью.
Другую цепь называют некодирующей цепью соответствующего гена.

Считывание информации с ДНК-матрицы на РНК, синтез идет с помощью РНК-полимераз.
У эукариот три РНК-полимеразы: (для синтеза тРНК, мРНК, рРНК).
У прокариот одна РНК-полимераза
синтезирует все виды РНК.
Транскрипция не связана с определенным этапом клеточного цикла.
Она предшествует трансляции – синтезу белка.

Механизм РНК-полимеразной реакции тот же, что и ДНК-полимеразной, направление синтеза 5’?3’, (субстратами служат нуклеозидтрифосфаты,
тимину ДНК комплементарен урацил в РНК).
РНК-полимераза – олигомерный белок
из 6-ти субъединиц.
Причем, σ – одинакова для всех полимераз и отвечает за связывание с промотором.
РНК-полимераза не требует «затравки».
РНК-полимераза не редактирует свои ошибки.

Оперон и транскриптон
Единицей транскрипции у прокариот является оперон
Единицей транскрипции у эукариот транскриптон

Структура оперона
Промотор - место инициации транскрипции, к которому присоединяется фермент РНК-полимераза; в ДНК E. coli имеется 2000 промоторов на 4,8×106 пар оснований;
Ген-оператор (или акцепторная зона у эукариот) - место связывания регуляторных белков, например, белка-репрессора;
Структурные гены, включающие информативные участки - экзоны и неинформативные участки - интроны;
Терминатор - последовательность нуклеотидов, сигнализирующая о завершении транскрипции.

Структура оперона

Структура транскриптона

Промотор прокариот
У бактерий функцию промотора выполняют две последовательности нуклеотидов на 5′-конце молекулы.
Одна из них называется блок Прибнова (ТАТААТ), центр которого располагается в положении -10 (10 нуклеотидов на 5′-конце от первого транскрибируемого нуклеотида, обозначаемого +1).
Другая последовательность, называемая -35 область, имеет последовательность ТТГАЦА.

Промотор эукариот
Эукариотические гены, кодирующие белки, имеют блок Хогнесса (ТАТААА) в положении -25, а также ЦААТ-блок (ГГЦЦААТЦТ) в положении -75.
Транскрипция у эукариот регулируется энхансерными (усиливающими) последовательностями, которые находятся далеко от стартового нуклеотида.

Промотор прокариот и эукариот

Терминация синтеза
Терминацию синтеза РНК вызывают длинные блоки АТ-последовательностей нуклеотидов в ДНК - терминатор (стоп-сигнал);
У ряда прокариот обнаружен белок, называемый ρ-фактором, который в участке терминации освобождает РНК от матрицы ДНК.

Факторы, необходимые для транскрипции
Матрица, которой является неспаренная цепь ДНК. В отличие от репликации транскрипция происходит на определенном фрагменте ДНК.
Субстраты. Для синтеза РНК необходимы четыре типа рибонуклеозид-5′-трифосфатов: АТФ, ГТФ, ЦТФ, УТФ. Разрыв макроэргической связи между α и β-остатками фосфорной кислоты обеспечивает процесс синтеза энергией.
Фермент ДНК-зависимая РНК-полимераза.

РНК-полимераза
РНК-полимераза E.coli состоит из 5 субъединиц (α2ββ′ω, м.м. 390 000) и шестой σ-субъединицы.
Фермент, состоящий из 6 субъединиц, называется холоферментом.
β -субъединица участвует в связывании рибонуклеозидтрифосфатов (катализирует синтез РНК),
β′-субъединица – в связывании фермента с ДНК-матрицей,
2α- субъединицы участвуют в инициации транскрипции;
ω-субъединица восстанавливает.
Структура фермента без σ-субъединицы называется кор-ферментом.

РНК-полимераза

РНК-полимераза (продолжение)
В эукариотических клетках присутствуют 3 ядерные РНК-полимеразы – I, II, III.
РНК полимераза I находится в ядрышке и участвует главным образом в биосинтезе рРНК;
РНК-полимераза II – осуществляет синтез мРНК;
РНК-полимераза III отвечает за синтез тРНК и 5S-рРНК.

РНК-полимераза

РНК-полимераза

Стадии транскрипции
Инициация
Элонгация
Терминация

Стадия инициации
РНК-полимераза с помощью σ-субъединицы через серию случайных актов ассоциации-диссоциации находит промотор и происходит присоединение всей молекулы фермента.
После синтеза цепочки РНК примерно из 8 рибонуклеотидов σ-субъединица отделяется от холофермента и присоединяется к другой молекуле РНК-полимеразы.
Синтезируемые цепи РНК имеют на 5′-конце обычно остаток ГТФ или АТФ (рррА, либо рррГ).
В отличие от синтеза ДНК затравка в этом случае не нужна.
Новообразованная цепь РНК имеет трифосфатную группу на 5′-конце и свободную ОН-группу на 3′-конце.

Стадия элонгации
РНК полимераза синтезирует цепь РНК в направлении 5′→ 3′ антипараллельно матричной цепи ДНК (т.е. матричная ДНК копируется в направлении 3′→5′).
В ходе транскрипции новосинтезированная цепь РНК временно образует короткие отрезки гибридной спирали ДНК-РНК.
По мере того, как расплетается очередной участок ДНК, транскрибированный участок восстанавливает свою двуспиральную конформацию.

Стадия элонгации (продолжение)
Максимальная скорость элонгации составляет примерно 50 нуклеотидов в секунду.
В отличие от ДНК-полимеразы РНК-полимераза не проверяет правильности новообразованной полинуклеотидной цепи.
В связи с этим надежность транскрипции значительно ниже, чем надежность репликации.
Частота ошибок при синтезе РНК составляет примерно одну ошибку на 104-105 нуклеотидов, что в 105 раз выше, чем при синтезе ДНК.
Гораздо более низкую надежность синтеза РНК клетка обходит тем, что с одного гена синтезируется много копий РНК-транскриптов.

Стадия терминации
Сигнал терминации синтеза молекулы РНК представляет собой определенную последовательность нуклеотидов, расположенную в рамках кодирующей цепи ДНК.
Процесс терминации у эукариот не достаточно изучен. У E.coli существует два механизма терминации: 1) с участием специфического белка, называемого ρ-фактором и 2) ρ-независимый механизм.

Посттрансляционная модификация РНК
В результате транскрипции образуются три типа предшественников РНК (первичные транскрипты): предшественник мРНК, или гетерогенная ядерная РНК (пре-мРНК или гяРНК), предшественники рРНК (пре-рРНК).
Они представляют собой копию оперона и содержат информативные и неинформативные последовательности.
Образование функционально активных молекул РНК называется процессингом и продолжается после завершения транскрипции.

Посттрансляционная модификация РНК
Вырезание неинформативных участков (интронов) из пре-мРНК.
Сращивание информативных участков (экзонов) – сплайсинг.
Модификация 5’- и 3’-концевых участков РНК.

Посттрансляционная модификация мРНК
Вырезание неинформативных участков пре-мРНК происходит с помощью рибонуклеаз и/или рибозимов
В ядре происходит модификация 5′ и 3′-концов мРНК.
К 5′-концу мРНК присоединяется олигонуклеотид, называемый «кэпом» (cap), который способствует стабилизации мРНК и связыванию мРНК с рибосомой для инициации трансляции.
К 3′-концу присоединяется полиадениловая последовательность (поли-А), состоящая из 50-200 нуклеотидов, который также защищает мРНК от ферментативного разрушения.
Затем мРНК связывается с белком информофером и транспортируется в цитоплазму к рибосомам.

Посттрансляционная модификация тРНК
Расщепление большого предшественника на молекулы тРНК.
Присоединение характерного ЦЦА-триплета к 3′-концу молекулы (акцепторный участок), к которому будет присоединяться соответствующая аминокислота.
Метилирование предшественников тРНК млекопитающих происходит в ядре, в расщепление и присоединение ЦЦА-триплета – в цитоплазме.

Посттрансляционная модификация рРНК
Метилирование на участках, формирующих в дальнейшем зрелые молекулы рРНК.
Расщепление общего первичного транскрипта на зрелые рРНК.
Формирование рибосом (большой и малой субъединицы) происходит в комплексе с белками.

Обратная транскрипция

ОБРАТНАЯ ТРАНСКРИПЦИЯ
Обратная транскриптаза содержится в РНК-ретровирусах, обладает тремя видами активности:
1) РНК-зависимой ДНК-полимеразной;
2) рибонуклеазной;
3) ДНК-зависимой ДНК-полимеразной.

Стадии обратной транскрипции
На матрице РНК по принципу комплементарности синтезируется ДНК - комплементарная ДНК (кДНК).
Происходит гидролиз РНК.
На кДНК синтезируется 2-я цепь ДНК.

Ингибиторы обратной транскриптазы
По принципу действия ингибиторы обратной транскриптазы делятся на нуклеозидные (НИОТ), нуклеотидные (НтИОТ) и ненуклеозидные (ННИОТ).
НИОТ поставляют для вирусной ДНК - неправильные нуклеозиды. Действие НтИОТ поставляют неправильные нуклеотиды.