Цитогенетические методы и их классификация

ЦИТОГЕНЕТИЧЕСКИЙ МЕТОД
Основан на изучении хромосом человека в норме и при патологии. В норме кариотип человека включает 46 хромосом — 22 пары аутосом и две половые хромосомы. Использование данного метода позволило выявить группу болезней, связанных либо с изменением числа хромосом, либо с изменениями их структуры. Такие болезни получили название хромосомных.

КАРИОТИПИРОВАНИЕ
Кариотип - это диплоидный набор хромосом в соматических клетках на стадии метафазы, характерный для данного вида.
Исследование кариотипа человека проводят с помощью образца периферической крови (1-2 мл), включающее три основных этапа: 1) культивирование клеток; 2) окраску препарата; 3) микроскопический анализ препарата.

Культивирование клеток проводится после забора образца крови. Кровь берется у взрослых из вены, у новорожденных — из пальца, мочки уха или пятки. Далее её помещают в питательную солевую среду в состав которой, в частности, добавлены вещества, «заставляющие» лимфоциты интенсивно делиться митозом. Через некоторое время в культуру клеток добавляют колхицин. Колхицин останавливает митоз на уровне метафазы. Именно во время метафазы хромосомы являются наиболее конденсированными .Методы цитогенетического исследования можно разделить на прямые — получение препаратов без культивирования и непрямые — получение препаратов хромосом из клеток, культивированных в искусственных питательных средах.

Объектом исследования при обоих методах цитогенетического исследования являются хромосомы в стадии метафазы митоза, поскольку только в этой стадии возможно точно идентифицировать хромосомы и выявление их нарушений. Исследование возможно и в стадии мейоза, но это сопряжено с трудностями получения биоптатов из половых желез

Прямые методы в основном используются для изучения костного мозга, но позволяют проводить анализ хромосом опухолевых клеток. Проводят стернальную пункцию костного мозга, помещают его в питательную среду, добавляют в нее колхицин, который останавливает деление клеток на стадии метафазы митоза. Клетки инкубируют 2—3 часа при 37 °С, затем готовят препараты хромосом.
При непрямом методе проводится культивирование. Наиболее доступным методом является анализ хромосом лейкоцитов периферической крови человека.

Важным этапом цитогенетического анализа является окраска полученных препаратов. Ее проводят простыми, дифференциальными и флюоресцентными методами.

Простая окраска обеспечивает групповую идентификацию хромосом. Используется она для количественного учета хромосомных аномалий при определении мутагенности среды (действия радиации, химических мутагенов и др.). С помощью этого типа окраски были открыты многие хромосомные болезни, а также хромосомные аберрации, вызывающие самопроизвольные аборты, врожденные пороки развития, канцерогенез и т. п.

С целью выявления структурной разнородности хромосом по длине, что выражается в виде чередования светлых и темных полос (эу- и гетерохроматических районов), применяются методы дифференциального окрашивания. Отмечается, что протяженность и рисунок полос специфичны для каждой хромосомы. Методы дифференциального окрашивания могут применяться для анализа хромосом, полученных из культур любых тканей.

Для систематизации хромосом используют две стандартные классификации: Денверскую и Парижскую. В основу Денверской классификации положены два принципа: длина хромосом и их форма (метацентрические, субметацентрические, акроцентрические), при этом используется метод сплошной окраски хромосом. По этой классификации все хромосомы разделены на семь групп, каждая пара хромосом имеет свой номер. Недостатком классификации является трудность в идентификации хромосом внутри группы.

Парижская классификация основывается на дифференциальном окрашивании метафазных хромосом. Каждая хромосома имеет свой индивидуальный рисунок, четкую дифференциацию по длине на светлые и темные полосы - диски (сегменты). Разработана система обозначения линейной дифференциации хромосом (номер хромосомы, плечо, район, сегмент).

ОПРЕДЕЛЕНИЕ Х-ПОЛОВОГО ХРОМАТИНА.
Половой хроматин (тельце Барра) - компактная темная глыбка, которая имеется в интерфазном ядре соматических клеток нормальных женщин. Половой хроматин представляет спирализованную Х-хромосому. Инактивация одной из Х-хромосом является механизмом, выравнивающим баланс генов в мужском и женском организме. Согласно гипотезе Марии Лайон, инактивация Х-хромосомы происходит на ранних стадиях эмбриогенеза (14 день), она носит случайный характер, причем инактивируются только длинные плечи Х-хромосомы. По числу глыбок полового хроматина можно судить о числе Х-хромосом (формула n+1, где n - число телец Барра). При любом числе Х-хромосом в активном состоянии будет только одна Х-хромосома. Цитогенетические методы используются для диагностики хромосомных болезней (изменение числа и структуры хромосом), определения пола, изучения хромосомного полиморфизма членов популяций.

ЦИТОГЕНЕТИЧЕСКИЙ МЕТОД ПРИМЕНЯЮТ В ЦЕЛЯХ:
изучения кариотипа человека
диагностики хромосомных заболеваний
изучения мутагенного действия различных веществ при генных и хромосомных мутациях
составлении генетических карт хромосом