Биоинформатическая обработка NGS-данных

Center for Research Informatics, The University of Chicago, Chicago, IL, USA
Контроль качества
Предварительная
обработка
Выравнивание
Постобработка
полученных данных
Определение
вариантов
Аннотация
Фильтрация,
Приоритизация

FastQ
Текстовый формат, позволяющий хранить не только нуклеотидную последовательность, но и данные о качестве прочтения каждого нуклеотида
Содержит 4 строки:
Идентификатор последовательности
Прочтение
Комментарий
Phred quality score
Clinical Applications for Next-Generation Sequencing, Academic press, 2015

Quality control (QC)
Предварительная обработка: удаление адаптеров с 3’-конца, обрезка концов с низким качеством прочтения
Cutadapt, Trimmomatic
Контроль качества прочтений по ряду параметров
FastQC

Выравнивание (alignment )
AAC - GCTAACGGTAA
AACCGCGAAC - - TAA
AACGCTAACGGTAA
AACCGCGAACTAA
BWA, Bowtie2, Novoalign
На выходе файл в формате SAM/BAM
SAM = Sequence Alignment Map
BAM = Binary Alignment Map
После выравнивания производится постобработка полученных данных с целью минимизировать количество ошибок, генерируемых на следующем этапе
Этап картирования на референсный геном
Референс
Рид

Определение вариантов (variant calling)
На этом этапе программа определяет варианты, отличающиеся от референсной последовательности (SNPs, SNVs, InDels)
SAMtools и GATK
На выходе = VCF (Variant Call Format)
Вариативность в геномах:
SNP = Single Nucleotide Polymorphysm (однонуклеотидный полиморфизм)
InDel = инсерция или делеция одного и более нуклеотидов

VCF
Стандартный формат для хранения данных о ДНК полиморфизмах, таких как: замены (SNPs), вставки, делеции и структурные варианты (SVs)
P.Danecek et al.

Аннотация, фильтрация, приоритизация
Проводится аннотирование вариантов и предсказание их влияния на кодируемый белок на основе анализа геномных координат фрагмента
(поиск по базам данных известных мутаций )
ANNOVAR, SnpEff
Убираются варианты с низким покрытием и низким качеством
Варианты ранжируются по частоте, приоритет отдается более редким мутациям
(предполагается, что у них большая степень вероятности вызвать заболевание)
Приоритизация вариантов по функциональному эффекту
(чей эффект наиболее склонен вызвать заболевание)
Например: нонсенс мутация обычно наносит больший вред, чем миссенс мутация
Для неизвестных вариантов предсказывается возможная патогенность на основе разработанных утилит

Визуализация
Integrative Genomic Viewer (IGV)
http://www.broadinstitute.org/igv
Thorvaldsdóttir et al.

Типы мутаций
Nonsense
Однонуклеотидные замены, приводящие к возникновению преждевременного терминирующего кодона
Мутации с заменой нуклеотида
Missense
Однонуклеотидные мутации, приводящие к замене аминокислоты в белке

Мутации вызванные инсерцией или делецией одного или нескольких нуклеотидов
Нормальная ДНК GAA-TGA-CTG-TCT-GGA
Нормальный белок Лей-Тре-Асп-Арг-Про
Мутантная ДНК GAA-GAC-TGT-CTG-GA
Мутантный белок Лей-Лей-Тре-Асп-
Делеция T
Frameshift
(со сдвигом рамки считывания)

Базы данных геномных вариантов человека
Медицинская генетика 2017, №7. Руководство по интерпретации данных,
полученных методами массового параллельного секвенирования (MGS).

Программы предсказания патогенности вариантов нуклеотидной последовательности (In silico)
Медицинская генетика 2017, №7. Руководство по интерпретации данных,
полученных методами массового параллельного секвенирования (MGS).

MutationTaster
www.mutationtaster.org
Polyphen2
http://genetics.bwh.harvard.edu/pph2/

Критерии для интерпретации вариантов
Для каждого варианта нуклеотидной последовательности специалист подбирает подходящие признаки, которые затем объединяет в соответствии с приведенными критериями:
1. Патогенный (p): Очень сильный (pvs1), Сильный (ps1-4), Средний (pm1-5), Вспомогательный (pp1-5)
2. Вероятно патогенный
3. Неопределенного значения
4. Доброкачественный(b): Очень сильный (ba1), Сильный (bs1-4), Вспомогательный (bp1-6)
5. Вероятно доброкачественный
Если вариант не отвечает критериям любого набора, или доказательства патогенности и доброкачественности противоречивы, то такой вариант следует считать вариантом неопределенного значения

Правила комбинирования критериев для интерпретации вариантов
Медицинская генетика 2017, №7. Руководство по интерпретации данных,
полученных методами массового параллельного секвенирования (MGS).

Пример медицинского заключения
Медицинская генетика 2017, №7. Руководство по интерпретации данных,
полученных методами массового параллельного секвенирования (MGS).