Planul prelegerii/seminarului la Microbiologia speciala

INFECŢIILE ZOOANTROPONOZE
MICROBIOLOGIA ŞI DIAGNOSTICUL DE LABORATOR AL ANTRAXULUI, TULAREMIEI, BRUCELOZEI ŞI PESTEI

Zooantroponozele reprezintă maladii ale animalelor care pot fi transmise oamenilor în rezultatul unui contact direct sau indirect cu populaţii animale infectate.
Unele dintre aceste infecţii - antraxul, tularemia, pesta, bruceloza – fac parte din categoria infecţiilor extrem de periculoase.
Sunt foarte contagioase (transmitere aerogenă, alimentară, prin contact direct, receptivitate generală)
Se manifestă nu doar ca epidemii, ci şi ca pandemii
Reprezintă infecţii cu evoluţie foarte gravă
Agenţii cauzali sunt rezistenţi în mediul extern

Microbiologia şi diagnosticul de laborator al antraxului
Clasificarea:
Familia Bacillaceae
Genul: Bacillus
Specii: Bacillus anthracis (patogen, agentul antraxului)
Bacillus cereus (intoxicaţii alimentare),
Bacillus polymyxa (genul Paenibacillus), Bacillus brevis (genul Brevibacillus), Bacillus subtilis – bacili antracoizi, producenţi de antibiotice
Bacillus anthracis a fost prima bacterie la care a fost demonstrat rolul în patogenia unei infecţii.
În 1877 Robert Koch a izolat microorganismul în cultură pură, demonstrând capacitatea lui de a forma endospori şi a produs antraxul experimental inoculându-l la animale.

Caracterele morfobiologice ale B.anthracis
Bacil mare (5-6 µm x 1 µm), cu extremităţile drepte (tăiate), gram-pozitiv, imobil (antracoizii sunt mobili), în produse patologice se prezintă sub formă de lanţuri scurte, iar în cultură – lanţuri lungi (“tulpină de bambus”).
Tulpinile virulente formează capsulă polipeptidică (acidul D-glutamic).
Sporul este ovoid, în poziţie centrală, nu deformează celula. Sporogeneza are loc în cultură, în sol şi în ţesuturi şi exsudate din animale moarte (în prezenţa oxigenului), dar nu în sânge sau ţesuturi de animale vii.

Caractere de cultură
B.anthracis nu este exigent nutritiv, cultivă pe medii uzuale. Facultativ-anaerob, t optimă – 35-37 grade, pH 7-7,4.
Peste 24 ore de incubare formează colonii R, mari, cu contur neregulat, opace, plate, uscate, rugoase (“coamă de leu”, “cap de meduză”). Nehemolitice pe geloză-sânge (antracoizii sunt hemolitici).
Pe geloză-ser, în exces de CO2, formează colonii S (producerea capsulei). Pe mediu cu 0,5-1 UI de penicilină B.anthracis formează lanţuri din forme globulare - “colier de perle” (proprietate absentă la antracoizi).
În bulion peptonat formează flocoane la fundul eprubetei, cu supernatantul clar.
B.anthracis este sensibil la fagul gamma.

The following figures (5, 6, and 7) from the CDC are reliable images of Bacillus anthracis grown as described in the figure legends.

Caractere biochimice
Activitate proteolitică – lichefiază gelatina în formă de “brad inversat”, peptonizează laptele, digeră serul coagulat, nu produce H2S.
Activitate zaharolitică – fermentează unele glucide: glucoza, maltoza, zaharoza, tregaloza, etc. Nu fermentează lactoza şi arabinoza.
Rezistenţa în mediul extern: formele vegetative sunt slab rezistente, sporii rămân viabili în sol decenii, se distrug la fierbere în 30-40 min.

Factori de patogenitate
Capsula din acidul poli-D-glutamic, codificătă de plasmida pX02. Inhibă fagocitoza şi puterea bactericidă a sângelui. Capsula joacă un rol important în etapele iniţiale ale infecţiei. Formarea capsulei are loc in vivo şi in vitro, pe medii cu ser şi în atmosferă cu 5 % CO2.

2. Exotoxina antraxului, codificată plasmidic (pX01)
Este constituită din 3 componente:
Factorul I, edematogen (EF), care este o adenilat-ciclază. Acumularea de cAMP duce la modificarea permeabilităţii membranare cu producerea edemului. Ținta – celulele endoteliale (efect - șoc hipovolemic, șoc septic)
Factorul III, letal (LF), responsabil de efectele letale ale toxinei anthrax. Este o protează Zn++ dependentă care induce producerea citokinelor TNF-alfa și IL1ß de către macrofage şi limfocite (efect – reacție inflamatoare, necroză, șoc septic)
Factorul II, antigen protector (PA), este responsabil de fixarea toxinei pe receptorii celulelor sensibile și pătrunderea ei în celulă. PA induce sinteza Ac antitoxici protectori.

Aparte, aceşti factori exercită activitate biologică nesemnificativă la animal. Din contra, combinaţii din doi sau trei factori toxici determină următoarele consecinţe la animale experimentale:
PA+LF = activitate letală
PA+EF = produce edem
PA+LF+EF = edem şi necroză cu efect letal
EF+LF = inactiv
Acest experiment sugerează că toxina antraxului are structură clasică de citotoxină bacteriană de tip A-B cu PA în calitate de B-fragment (de fixare pe receptori celulari) şi cu factorii EF şi LF cu funcţie de fragment A (activ), care acţionează în interiorul celulei.

Structura antigenică a B.anthracis
Ag capsular (induce Ac neprotectori)
Ag polizaharidice somatice termostabile (depistate în reacţia de precipitare Ascoli)
Toxina (componentul PA), induce formarea Ac protectori, neutralizanţi

Epidemiologia şi patogeneza antraxului
Sursa de infecţie – animalele erbivore bolnave de antrax (ovine, caprine, bovine, suine). Solul contaminat cu spori este un rezervor de germeni important şi permanent (decenii).
Transmiterea:
prin contact direct cu animalele bolnave sau produse contaminate (carne, piei, lână, blană, etc), păşuni şi nutreţuri contaminate, cu pătrunderea agentului prin tegumentul lezat
aerogen, prin inhalarea sporilor de B.anthracis
pe cale alimentară (consum de carne de la animale bolnave de antrax insuficient prelucrate termic)
prin injectarea drogurilor intravenos
În majoritatea cazurilor antraxul se manifestă ca boală profesională a îngrijitorilor de animale, personalului de la abatoare, întreprinderi de prelucrare a produselor animaliere, veterinarilor, zootehnicienilor, măcelarilor, tăbăcarilor, etc.

Formele clinice de antrax
I. Antraxul cutanat , “pustula malignă” (forma cea mai frecventă). Sporii intră printr-o leziune a tegumentului, germinează şi proliferează la poarta de intrare, cu dezvoltarea unui edem gelatinos local caracteristic.

La poarta de intrare, peste 12-36 ore de la penetrare, apare o papulă, care evoluează rapid într-o veziculă, apoi în pustulă cu conţinut sanguinolent. La spargerea pustulei se formează o leziune necrotică, prezentând în centru o escară neagră înconjurată de vezicule satelite. Leziunea se localizează mai frecvent pe mâini, faţă, ceafă, etc.
Pătrunderea în sânge determină diseminarea sistemică a bacteriei.

II. Antraxul pulmonar apare la inhalarea sporilor de B. anthracis , care sunt înglobaţi de macrofagele alveolare unde ei germinează şi se multiplică, determinând o pneumonie foarte gravă cu edem.

Urmează infectarea ganglionilor limfatici mediastinali cu dezvoltarea unei necroze hemoragice. Pacientul manifestă febră, stare de rău, mialgie, tuse ne-productivă. Din ganglionii limfatici infecţia poate trece în sânge.
Decesul poate
surveni în 24 h.

III. Anthraxul digestiv apare în urma consumului de carne infectată. În mucoasa intestinală se dezvoltă procese identice cu cele din antraxul cutanat (enterocolită ulceroasă). Clinic: vomă şi diaree, cu sânge în masele fecale.

Poate urma invazia ganglionilor limfatici mezenterici şi a sângelui, asociată cu prostraţie profundă, şoc şi moarte.
Meningita poate apare (foarte rar) ca urmare a oricărei
forme de antrax

Diagnosticul de laborator al antraxului
Se efectuează numai în laboratoare specializate cu respectarea unor reguli stricte de securitate.
Prelevate (în funcţie de forma clinică): exsudat /cruste din leziunea cutanată, spută, sânge, LCR, materii fecale, bioptate din ganglioni limfatici, probe necroptice, probe de la animalul suspect şi elemente din mediul extern

Examenul microscopic direct
În frotiuri pregătite din prelevate şi colorate Gram sau cu albastru de metilen se observă bacili mari cu morfologia caracteristică, izolaţi sau în lanţuri scurte. Sporii sunt rareori prezenţi.

2. RIF

Examenul bacteriologic
Prelevatele monomicrobiene se însămânţează pe geloză şi geloză-sânge, iar cele polimicrobiene se încălzesc în prealabil 10 min la 75 grade C. Incubarea la 37 C timp de 24 ore. Sângele – în bulion glucozat, repicări zilnice timp de 7 zile pe geloză-sânge.
Examinarea coloniilor crescute, selecţia celor suspecte şi acumularea lor
Identificarea culturii pure acumulate şi diferenţierea de antracoizi.

Table 1. Differential Characteristics of B. anthracis B. cereus and B. thuringiensis

Examenul biologic
Se inoculează prelevatele la cobai sau şoareci, care sunt foarte sensibili la infecţie. După moartea lor (36-48h) bacilii sunt depistaţi în frotiuri din sânge şi organe.
Depistarea Ag polizaharidice termostabile în prelevate (reacţia de precipitare inelară Ascoli)
PCR
Diagnosticul serologic. Ac anti-antrax pot fi depistaţi la convalescenţi în RP sau ELISA
Diagnosticul imunologic (proba cutanată alergică). Se pune în evidenţă starea de hipersensibilizare prin inocularea intradermică a 0,1 ml de antraxină (extract din tulpina vaccinantă de B.anthracis). Reacţie pozitivă – edem şi hiperemie cu diametrul de peste 8 mm.

Tratamentul antraxului
Antibiotice (peniciline, cefalosporine, fluorochinolone)
Imunoglobulina antiantrax
Anticorpi monoclonali
Profilaxia specifică a antraxului
Depistarea şi izolarea animalelor bolnave, incinerarea animalelor moarte sau îngroparea adâncă a cadavrelor şi acoperirea cu var nestins
Vaccinarea animalelor
Imunizarea personalului expus cu vaccin viu atenuat, vaccin inactivat, vaccin acelular (elaborat din tulpini acapsulate avirulente, conținând proteina PA). În curs de elaborare – vaccin cu PA și antigen capsular.

Microbiologia şi diagnosticul de laborator al tularemiei
Clasificarea
Familia Francisellaceae
Genul Francisella
Specii: F.tularensis (agentul cauzal al tularemiei)
F.philomiragia (infectii sistemice)

Se cunosc 4 biovaruri (subspecii) de F.tularensis, care diferă dupa activitatea biochimică, virulenţă şi răspândire geografică:
F.tularensis tularensis (nearctica) (tip A; foarte virulentă, raspândită în America de Nord)
F. tularensis holarctica (palearctica) (tip B; mai puţin virulentă, cu raspândire în Europa)
F. tularensis mediasiatica: virulenţă similară cu F. tularensis holarctica
F. tularensis novicida: virulenţă redusă, cauzeaza infecţie numai la gazde imunocompromise. Izolată în SUA.

Prima descriere a tularemiei a fost realizată în Japonia în 1837. Denumirea agentului provine de la regiunea Tulare, California, unde, în 1911, în timpul unei epizootii printre veveriţele de pământ, a fost izolată tulpina bacteriană.
Dr Edward Francis, în 1928, studiază şi descrie agentul cauzal şi patogeneza maladiei prin experienţă personală în peste 800 cazuri.
F. tularensis are răspâdire ubicvitară, parazitând peste 100 de specii de animale sălbatice (în special rozătoare), păsări şi insecte şi persistă în apa din zonele unde se întâlnesc aceste animale.
Toate mamiferele fac o septicemie cu prezenţa bacteriilor în toate tesuturile.

Caracterele morfobiologice ale F.tularensis
Morfologia: F.tularensis reprezintă o cocobacterie foarte mică (0.2-0.5 µm x 0.7-1.0 µm), gram-negativă, uneori se colorează mai intens la poli, pleomorfă, imobilă, asporogenă, tulpinile virulente posedă capsulă.

Caractere de cultură: bacteria nu poate fi cultivată pe medii uzuale. Pentru izolare se utilizează medii îmbogăţite:
mediul Francis (geloză + sânge de iepure + cisteină + glucoză)
Mediul McCoy (cu gălbenuş de ou)
Geloză-ciocolată
Cultivă la 35 - 37 grade, în aerobioză. Peste 2-4 zile apar colonii S, mici (1 - 2 mm în diametru), albe-cenuşii, mucoide, cu marginile regulate şi suprafaţa lucioasă.

Caractere biochimice:
F.tularensis este catalazo+ şi oxidazo-, nu descompune ureea, produce H2S, unele biovaruri fermentează glicerolul.
Rezistenţa în mediul extern
Mi/organismele pot supravieţui perioade îndelungate de timp în apă, nămol, cadavre de animale (mediu umed).
F.tularensis este distrusă la 56 grade în 10 minute, dar congelarea permite conservarea bacteriei.

Factorii de patogenitate :
Capacitatea de a penetra în macrofage, supravieţuind şi multiplicându-se în interiorul celulelor până la moartea lor (parazitism facultativ intracelular)
Pili tipul IV
Sistem de secreție tipul VI
Capsula (rol protector)
Endotoxina (LPZ)

Epidemiologia şi patogeneza tularemiei
Sursa de infecţie – animale bolnave sau cadavre de animale, transmiterea de la om la om nu are loc.
Rezervorul principal – mamifere mici şi medii (iepuri, veveriţe, şobolani, şoareci, rozătoare acvatice, lemingi). Omul, pisicile, câinii, anumite specii de păsări, peşti şi amfibii pot fi gazde accidentale
Vectori – insecte (tăuni, ţânţari, căpuşe )
Porţi de intrare – tegumentul (chiar intact), mucoasele, conjunctiva

Deer ticks

Transmiterea:
Contact cu animale infectate, cadavre sau cu apa contaminată (lacuri, bazine, etc)
Aerogen prin inhalare (vânători...)
Alimentar, prin consum de apă sau alimente infectate
Înţepătura artropodelor hematofage
Francisella tularensis este una dintre cele mai virulente bacterii. Câteva zeci de mi/o (10-50) pot provoca suferinţe grave.

Patogeneza şi
formele clinice de tularemie
Francisella tularensis este o bacterie facultativ intracelulară. Iniţial infectează macromacrofmacrofagele, cu diseminarea mi/o şi afectarea diferitor organe, inclusiv plămânii, ficatul, splina, ganglionii limfatici. Un rol important în patogeneza leziunilor îl joacă hipersensibilitatea tardivă.

Formele clinice de tularemie sunt în relaţie cu calea de pătrundere:
- Forma ulceroganglionară (70-85% de cazuri), penetrarea agentului patogen prin tegument sau mucoase. Mi/o se multiplică local şi determină apariţia, peste 3-5 zile de la expoziţie, a unei papule la locul de inoculare. Peste cîteva zile se transformă în pustulă, care se ulcerează rapid. Ulcerul are 2 - 4 cm în diametru şi marginile neregulate. Uneori ulcerul poate fi acoperit cu o crustă neagră (asemănătoare cu escara în antrax).

Bacteriile se răspândesc spre ganglionii limfatici regionali, unde cauzează limfadenite necrotice, înconjurate de infiltrate granulomatoase (bubonul tularemic). Ganglionii limfatici afectaţi devin fluctuanţi, uneori creând canale de drenare în tegument. Mi/o pot disemina hematogen infectând multiple organe, cu dezvoltarea septicemiei.
Forma ganglionară se manifestă prin afectarea ganglionilor limfatici regionali, leziunea de la poarta de intrare lipseşte.

Forma oculoganglionară apare la pătrunderea agentului cauzal prin conjunctivă. Se dezvoltă necroza şi ulceraţia conjunctivei, cu infiltraţie limfocitară. Din conjunctivă bacteriile trec în ganglionii limfatici preauriculari, submandibulari sau cervicali, provocând leziuni similare cu cele din tularemia ulceroganglionară.

Forma orofaringeană (angino-ganglionară)
Mi/o intră prin mucoasa orofaringelui în urma ingestiei sau inhalării lor.
Uzual se dezvoltă faringite sau tonzilite exsudative, cu ulceraţie ulterioară. Pătrunderea în ganglionii limfatici cervicali determină necroză şi supuraţie.
Forma tifoidică (abdominală), cu afecţiuni generalizate. Mi/o pătrund în sânge prin tegument sau mucoase şi afectează plămânii şi organele reticulo-endoteliale. Determină frecvent septicemie şi şoc
Forma pneumonică, foarte gravă. Mi/o pătrund în plămâni aerogen sau hematogen.

Diagnosticul de laborator al tularemiei
Se realizează doar în laboratoare specializate
Prelevate: în funcţie de forma clinică: serozitate din leziunea cutanată sau conjunctivă, exsudat faringean, punctat din ganglionul limfatic afectat, spută, sânge.
Metode directe de diagnostic
Examenul microscopic direct este foarte dificil, aproape imposibil. RIF are o sensibilitate mai mare

2. Examenul bacteriologic.
Izolarea F.tularensis direct din prelevate este practic imposibilă. Uzual se utilizează inocularea prelevatelor la animale experimentale sensibile (şoareci, cobai). La necropsii se studiază frotiuri-amprente din organele afectate (Giemsa, RIF), se fac însămânţări pe medii speciale (Francis, Mc Coy). Tulpinile izolate sunt identificate morfologic, cultural, biochimic, antigenic (RA cu seruri anti-F.tularensis).

Diagnosticul indirect
Serodiagnosticul. Detectarea Ac este un element esenţial în diagnosticul tularemiei. Ac apar după ziua a 7 de boală, ating titrul maxim peste 1-2 luni (1:1000 sau mai mult) şi persistă mai mulţi ani. RA cu suspensie de bacterii omorâte este cea mai utilizată. Titrul diagnostic – 1:80, cu creşterea lui în dinamică de cel puţin 4 ori.
ELISA este posibilă.
2. Intradermoreacţia cu tularină Hipersensibilitatea poate fi testată peste 5 zile de la debutul bolii.

Tratamentul tularemiei
Antibiotice: aminozide (streptomicină, gentamicină), tetracicline, cloramfenicol, fluorochinolone, eritromicină (există şi tulpini rezistente)
Profilaxia tularemiei
Informarea persoanelor expuse contaminării
Supraveghere sanitară
Vaccinarea contingentelor de risc cu vaccin viu atenuat asigură imunitatea pe o durată de 5-7 ani

Microbiologia şi diagnosticul de laborator al pestei
Pesta (din latină pestis, maladie contagioasă) este o maladie cu multiple fațete mortală pentru om. Ea este cauzată de Yersinia pestis, descoperită de Alexandre Yersin de la InstitutInstitutulInstitutul Pasteur în 1894.

Familia Enterobacteriaceae
Genul Yersinia
Specia Yersinia pestis
Se disting 3 varietăți de tulpini - orientală, medievală și antică.
Caractere morfotinctoriale – yersiniile reprezintă bastonașe drepte, uneori coco-bacterii Gram negative, uneori colorate bipolar, acapsulate, asporulate, imobile la 37C.

Caractere de cultură – yersiniile sunt mi/o anaerobe facultative, cultivă pe medii uzuale la 25-28 C.
În BP cultura se manifestă printr-un voal la suprafață și un aspect floconos în interior. Pe geloză peste 48h apar colonii R mari, cu margini neregulate
Activitate biochimică – catalaza+, oxidaza-, fermentează glucoza, reduce nitrații în nitriți.
Yersiniile sunt rezistente în mediul extern şi în cadavre de animale.

Factori de patogenitate
Proteina lcr (low calcium response) – permite multiplicarea intracelulara a bacteriei)
Proteinele V si W – determina proliferare rapida si septicemie
Proteinele Yops, 11 proteine responsabile de citotoxicitate, inhibarea migrarii fagocitelor si a inglobarii, agregarea trombocitelor
Antigenul F-1 – complex proteic-polizaharidic, antifagocitar, se formeaza doar in organismul mamiferelor
Coagulaza si activatorul de plasminogen, determina formarea microtrombilor, promoveaza diseminarea bacteriilor, distruge C3b de pe suprafata bacteriilor

Aspecte epidemiologice
Sursa de infecție şi transmiterea
Rozătoarele sălbatice constituie rezervorul natural al maladiei. Yersinia este în principal vehiculată de un șobolan, Rattus rattus, care o transmite la om prin intermediul puricilor infectați (Xenopsylla cheopsis, Nosopsyllus fasciatus). Foarte rar omul se infectează prin muşcătura şobolanului infectat sau consumându-l.
Iepurii și carnivorele pot infecta omul prin contact direct sau mușcătura animalului infectat.
În epidemii transmiterea se poate efectua interuman pe cale aerogenă.

După înţepătura unui purice infectat, germenul se multiplică la locul de inoculare cu formarea unei vezicule-pustule apoi pătrund în sistemul limfatic și colonizează ganglionii regionali în care se multiplică. Peste 2-5 zile apar semne de limfadenită hemoragică (bubonul pestos). Pesta bubonică – 90% din cazurile de pestă.
Diseminarea hematogenă permite bacteriilor să atingă ansamblul organelor cu apariția semnelor clinice de septicemie. Aflat in sange bacteriile determina coagulare intravasculara diseminata si leziuni purpurice (hemoragii). Afectarea plămânilor duce la pesta pulmonară secundară, cu expectorații sanguinolente bogate în germeni, foarte contagioase. Contactul cu acești pacienți duce, prin contact direct, la apariția pestei pulmonare primare care prezintă o mortalitate de 90-100% în lipsă de tratament.

Diagnosticul de laborator al pestei
Se realizează în laboratoare specializate cu regim special strict.
Prelevate: punctat din bubon, spută, sânge. Toate prelevatele de la o persoană infectată sunt foarte contagioase și manipularea lor cere măsuri speciale de precauție.
Examenul direct
1. Examenul microscopic al punctatului din bubon colorat Gram sau Giemsa poate fi evocator (bacterii Gram-, ovoide, cu colorație bipolară). RIF nu este destul de semnificativ, deoarece există recții încrucișate cu alte yesinii.

2. Examenul bacteriologic (izolarea culturii pure cu identificarea ei ulterioară) este o investigație de bază.
În pesta pulmonară, diagnosticul este confirmat prin izolarea culturii din spută sau din aspirat bronșic.
Hemocultura (izolarea culturii din sânge) reprezintă examenul-cheie în forma septicemică.
Pot fi examinate și probe necroptice, deoarece germenul este foarte rezistent în cadavre în curs de putrefacție
3. Depistarea rapidă a antigenelor F1.

Tratamentul pestei
Antibiotice (streptomicină, gentamicină, doxiciclină, cloramfenicol)
Profilaxia pestei
Izolarea bolnavilor
Persoanele de contact – carantină 6 zile