РАЗРАБОТКА И АДАПТАЦИЯ ДИАГНОСТИЧЕСКОГО ПРЕПАРАТА ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ АНТИТЕЛ К ВИРУСУ КЛЕЩЕВОГО ЭНЦЕФАЛИТА МЕТОДОМ ИММУНОФЕРМЕНТНОГ

Целью работы явилась адаптация и разработка диагностического препарата – тест-системы для выявления иммуноглобулинов класса М (IgМ) и G (IgG) к вирусу клещевого энцефалита методом иммуноферментного анализа.
Задачи:
подобрать оптимальный антиген, пригодный для использования в тест-системе;
приготовить культуральные и мозговые антигены вируса клещевого энцефалита с использованием местных штаммов;
приготовить иммунную асцитическую жидкость к вирусу клещевого энцефалита с использованием местных штаммов и нормальную асцитическую жидкость;
проверить возможность использования приготовленных сывороток в качестве положительного и отрицательного контролей;
разработать схемы технологического процесса и провести пробный иммуноферментный анализ с использованием полученных материалов

Таблица 1
Приготовленные антигены

Таблица 2
Активность мозгового антигена А в РСК
Таблица 3
Активность мозгового антигена В в РСК
Таблица 4
Активность мозгового антигена С в РСК

Таблица 5
Активность культурального антигена D в РСК
Таблица 6
Активность культурального антигена E в РСК
Таблица 7
Активность культурального антигена F в РСК

Таблица 8
Проверка полноты инактивации опытных антигенов (I пассаж)
Таблица 9
Проверка полноты инактивации опытных антигенов (II пассаж)

Таблица 5
Активность культурального антигена D в РСК
Таблица 6
Активность культурального антигена E в РСК
Таблица 7
Активность культурального антигена F в РСК

Таблица 5
Активность культурального антигена D в РСК
Таблица 6
Активность культурального антигена E в РСК
Таблица 7
Активность культурального антигена F в РСК

Характеристики полученных антигенов по выбранным критериям
* - активность для мозговых антигенов выражена в полной степени гемолиза при наибольшем разведении, для культуральных максимальный процент светящихся клеток в разведении 1:32.
Таблица 10

Таблица 11
Уровень накопления антител в полученной ИАЖ

Таблица 12
Варианты постановки ИФА
* антитела против IgM и IgG белой мыши, меченные пероксидазой
** антитела против IgG, меченные пероксидазой
*** сыворотка крови человека с диагнозом клещевой энцефалит

Таблица 13
Оптическая плотность исследуемых образцов, при различных вариантах постановки ИФА

Соотношение оптических плотностей положительного и отрицательных контролей допустимое, т.е. результаты, полученные при постановке ИФА считали достоверными.
В разрабатываемой тест-ситеме предпочтительно использовать культуральный антиген Е.
В качестве положительного контроля можно использовать полученную ИАЖ в сочетании с конъюгатом «античеловек».
В качестве отрицательного контроля в разрабатываемой тест-системе целесообразно использовать сыворотку крови здорового человека.

Таблица 14
Оптическая плотность исследуемых сывороток крови
Таблица 15
Коэффициенты позитивности (КП) исследуемых сывороток крови

1. Иммунизация лабораторных животных
2. Введение
адъюванта Фрейнда
3. Инактивация ИАЖ
4. Проверка ИАЖ
Получение иммунной асцитической жидкости (ИАЖ)
Рис. 1. Технологическая схема производства ИАЖ

Инфицирование культуры клеток
Определение инфекционной активности вируса КЭ
Обеззараживание вируссодержащего материала
Инактивация антигена вируса КЭ
Очистка антигена вируса КЭ
Концентрирование антигена вируса КЭ
Проверка активности антигена вируса КЭ
Получение антигена вируса КЭ
Рис. 2. Технологическая схема производства антигена вируса КЭ

ВЫВОДЫ
Проведенные исследования позволили приготовить и отобрать антиген для использования в разработанной иммуноферментной тест-системе. Наиболее пригодным является антиген, полученный на культуре клеток.
Показали возможность использования полученной иммунной асцитической жидкости в сочетании с конъюгатом «античеловек» в качестве положительного контроля в тест-системе.
Разработали (определили технологические схемы производства компонентов препарата), адаптировали и оптимизировали иммуноферментную тест-систему для выявления антител к вирусу клещевого энцефалита.