Фаговый дисплей

George P Smith, 1941. Основатель метода фаговый дисплей.

НИТЧАТЫЙ ФАГ М13

pIII
pVI
pVII
pIX
НИТЧАТЫЙ ФАГ М13
pVIII

pIII
pVI
pVII
pIX
НИТЧАТЫЙ ФАГ М13
pVIII

pVIII
pIII
pVI
pVII
pIX
ФАГОВАЯ
БИБЛИОТЕКА
НИТЧАТЫЙ ФАГ М13

БЕЛОК-МИШЕНЬ
АДСОРБИРОВАННЫЙ
ТВЕРДОМ НОСИТЕЛЕ
БИБЛИОТЕКА
АФФИННАЯ СЕЛЕКЦИЯ/БИОПАННИНГ

БЕЛОК-МИШЕНЬ
АДСОРБИРОВАННЫЙ
ТВЕРДОМ НОСИТЕЛЕ
отмывка
БИБЛИОТЕКА
СЕЛЕКЦИЯ
АФФИННАЯ СЕЛЕКЦИЯ/БИОПАННИНГ

БЕЛОК-МИШЕНЬ
АДСОРБИРОВАННЫЙ
ТВЕРДОМ НОСИТЕЛЕ
отмывка
элюция
ОБОГАЩЕННЫЙ
ФАГОВЫЙ ПУЛ
БИБЛИОТЕКА
СЕЛЕКЦИЯ
AМПЛИФИКАЦИЯ
АФФИННАЯ СЕЛЕКЦИЯ/БИОПАННИНГ
НОВЫЙ РАУНД СЕЛЕКЦИИ

Как чужеродный полипептид может быть сшит
с фаговыми белками
pIII
pVIII
pVI
сигнальный
пептид
встройка
N-концевой домен
C-концевой домен
pIII
pIII
pIII
лейциновая
застёжка
pIII
Fab

ТИПЫ ДИСПЛЕЯ НА НИТЧАТОМ ФАГЕ
3 33 3+3 8 88 8+8
A B A B

ИССЛЕДОВАНИЯ СВОЙСТВ РЕКОМБИНАНТНЫХ ФАГОВ
M13B A E G D D P A K A...
M13B1 A E G E D P A K A...
M13BOM1 A E G E D Q A S G D P A...
M13BOM2 A E G E G Q A S G D P A...
M13BOL1 D H L M P D P A...
M13BOL2 A E G E D R W M P D P A...
кислый
домен
1-6
амфипатичный
домен
7-20
гидрофобный
домен
21-39
основной
домен
40-50

ИССЛЕДОВАНИЯ СВОЙСТВ РЕКОМБИНАНТНЫХ ФАГОВ
КОНТУРНАЯ ДЛИНА ФАГОВ
Контурные длины рекомбинантных фагов совпадают с точностью 0.3% и превышают
длину исходного фага М13mp10 на 10% за счет встройки гена Ар.

ПОЛУЧЕНИЕ БАКТЕРИОФАГА М13BOL2
p17
11 19
... G E L D R W E K I ...
M13BOL1
5 6 7 8 9
D H L M P D P A K A ...
5'...GCT GAG GGT GAG GAT CAC CTG ATG CCT GAT CCC GCA AAA GCG...3'
3'-CCA CTC CTA G G C TAC GGA C-5'
C AC
M13BOL2
1 2 3 4 5 6 7 8 9
A E G E D R W M P D P A K A ...
5'...GCT GAG GGT GAG GAT CGC TGG ATG CCT GAT CCC GCA AAA GCG...3'
олигонуклеотид-
направленный
мутагенез

ИССЛЕДОВАНИЯ СВОЙСТВ РЕКОМБИНАНТНЫХ ФАГОВ
ИММУНОГЕННОСТЬ
А – ВИЧ-1 положительная сыворотка человека
В – кроличья сыворотка анти-М13mp10
C – кроличья сыворотка анти-М13BOL2

ДЕКАПЕПТИДНЫЕ ВСТРОЙКИ
ЖИЗНЕСПОСОБНЫЕ ФАГИ
PM48.1 LRQYSAQGA
2 RNPIYYSTT
6 KGNFAGPSG
7 HNRSTVDIP
4 TNALQTALP 5 RYFLNSAAP
8 RTGYGSAPT
12 YGGGRSSAT
13 GSSWGYASP
14 TPLHFDSGA
23 THYQGRAGA
PCR1 SRYHQSPGA
PCR9 LRSVNQGYA
PCR10 HPTNYYPGS
PCR12 QHADLVSLP
PCR13 PYRSPPSSQ
PCR17 YARNASHLA
PCR22 RRSSNAVPLP
ВСТРОЙКИ В ПЛАЗМИДУ
F2 LGRNFIAVT F14 RHDIPGRTE F28 VRNCSTLWG
F3 VLVHMNNNT F15 EKEMQFLNG F29 WPRLGLKLL
F4 INRTPLKTR F16 NPSKIASS 1 QNPPPPTLT
F5 LLFSRSRRP F18 SKPIGSTRQ 3 AQMSGRTAS
F6 QRSISPTRR F19 THSHFTHPE 4 TGNFCLNLT
F8 PPRIHRAPR F20 DHANKNRHG 6 LTNLSSGRP
F9 EYRAPLAPG F22 SDKSSPQMP 7 EHDRNLKPP
F10 NTSARSRHP F23 RFATRTISR 10 VTDGATWGS
F11 LIRTGARAT F26 ADAIGVPLR 11 RSLPPTYHP
F12 PHSLDSFRL F27 IQYPQSAAS 12 RTLCSPPAT
F13 FCGARRTSP
ВСТРЕЧАЕМОСТЬ В ФАГЕ
ВСТРЕЧАЕМОСТЬ В ФАГМИДЕ

ЗАВИСИМОСТЬ ОТ ДЛИНЫ ВСТРОЙКИ

ПЕПТИДНАЯ БИБЛИОТЕКА ТИПА 8

ЭВОЛЮЦИЯ ПЕПТИДНОЙ БИБЛИОТЕКИ
КОНСЕНСУСНАЯ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ
1 2 3 4 5 6 7
РАУНД 0 Х Х Х Х Х Н(8.4) Х
1 N(5.4) Х X X A(4.7)I(6.7)P(13.4)
I(4.0)L(4.0)
S(3.1)M(4.0)
2 N(8.6)P(3.4)G(3.4)A(3.4)A(5.2)F(13.8)P(14.6)
P(3.4)I(3.4)

ДИСПЛЕЙ ПЕПТИДОВ ТИПА 8+8
фагмида + фаг-помощник

РАЗРАБОТКА ТЕСТ-СИСТЕМЫ ДЛЯ HCV

СЕЛЕКЦИЯ И ИММУНОСКРИНИНГ

ИДЕНТИФИКАЦИЯ НОВЫХ ЛИГАНДОВ ДЛЯ HCV-СПЕЦИФИЧЕСКИХ АНТИТЕЛ

АФФИННОЕ СОЗРЕВАНИЕ КЛОНА РА12
PA12 S R Q L N K L F G I E
Библиотека S* R* Q* L* N* K* L* F* G* I* E* N N

ФАГОВЫЕ ПЕПТИДЫ

ОТ ФАГОВЫХ ПЕПТИДОВ К СИНТЕТИЧЕСКИМ
MAP – Multiple Antigenic Peptide

ОТ ФАГОВЫХ ПЕПТИДОВ К СИНТЕТИЧЕСКИМ

КОММЕРЧЕСКИЕ ТЕСТ-СИТЕМЫ

НЕОПРЕДЕЛЕННЫЕ СЫВОРОТКИ
6 сывороток – 0
8 сывороток – 1 пептид
7 сывороток – 2 группы пептидов
10 сывороток – множественная реактивность

НЕОПРЕДЕЛЕННЫЕ СЫВОРОТКИ
На найлоновой мембране иммобилизованы
следующие пептиды, разделенные на 10 групп,
согласно их специфичности: (A): m1909.2 и
m1913.2; (B): m1901.31, m3323.3 и m3362.3;
(C): m1977.1; (D): m3551.3; (E): 3566.3; (F):
m858, mF78 и mH1; (G): mA12.1, mA12.2 и mA12.13;
(H): mB11.17; (I): mG21.2; (J): m1929A3.1,
m1929C3.4 и m1929.21. Дополнительная линия
содержит очищенные человеческие
иммуноглобулины в качестве внутреннего
положительного контроля.

ДИСПЛЕЙ АНТИТЕЛ

Fab
scFv
ДИСПЛЕЙ АНТИТЕЛ
источник человеческих клеток
мРНК
кДНК
специфическая PCR для
амплификации VH и VL
клонирование в фаговом векторе
электропорация компетентных клеток
наработка фага с использованием
фага помощника

ДИСПЛЕЙ РЕКОМБИНАНТНЫХ АНТИТЕЛ,
БИБЛИОТЕКИ
Качество библиотеки зависит от:
a. размера библиотеки
b. разнообразия
c. источника генов Ig
Источник генов Ig:
лимфоциты периферической крови (PBL)
селезенка
костный мозг
околоопухолевые лимфатические узлы(TDLN)
отдельные гены антител (синтетические библиотеки)
лимфоциты инфильтрированные в опухоль (TIL)
клональность < 1/20.000 7% 18-78%
PBL TDLN TIL

ДИСПЛЕЙ РЕКОМБИНАНТНЫХ АНТИТЕЛ

ДИСПЛЕЙ РЕКОМБИНАНТНЫХ АНТИТЕЛ
рКМ17
рКМ18
рКМ19
scFv anti-CEA
FLAG
N-terminus C-terminus
pIII

ДИСПЛЕЙ РЕКОМБИНАНТНЫХ АНТИТЕЛ

ДИСПЛЕЙ РЕКОМБИНАНТНЫХ АНТИТЕЛ
1. Production of human hybridomas, obtained from TIL, able to secrete tumor-specific
antibodies [Sikora K et al., Lancet 1982; Sikora K et al., Br.J.Cancer 1983];
2. B cell expansion of TIL from human tumor biopsies [Punt CJA et al., Cancer Immunol.
Immunother. 1994];
3. B cell expansion of melanoma-derived TIL and following cloning the scFv
antibody from single B cell clone with specific melanoma reactivity [Zang H et al.,
Cancer Res. 1995];
4. Subcutaneous transplantation of human lung cancer tissue in immunodeficient mice
producing human antibodies derived from TIL-B, which recognized two tumor-specific
proteins [Imahayashi S et al., Cancer Invest. 2000; Yasuda et al., Cancer Res. 2002]
Антитела, происходящие из TIL-B способны узнавать раковые клетки

ДИСПЛЕЙ РЕКОМБИНАНТНЫХ АНТИТЕЛ
НС
PCR амплификация района V(D)J

ДИСПЛЕЙ РЕКОМБИНАНТНЫХ АНТИТЕЛ
HC

B клетки
мРНК
кДНК
гены Ig
сборка scFv, конструкция библиотеки
опухоль
ДИСПЛЕЙ РЕКОМБИНАНТНЫХ АНТИТЕЛ

ДИСПЛЕЙ РЕКОМБИНАНТНЫХ АНТИТЕЛ
СЕЛЕКЦИЯ НА ОПУХОЛЕВЫХ АНТИГЕНАХ

ДИСПЛЕЙ РЕКОМБИНАНТНЫХ АНТИТЕЛ
АНТИ-MUC1 MB5
АНТИ-СЕА СВ37

ИНКУБАЦИЯ
ОТМЫВКА
ЭЛЮЦИЯ,
АМПЛИФИКАЦИЯ ФАГА
Селекция антител на клетках MCF7

Селекция антител на клетках MCF7

Селекция антител на клетках MCF7

Оптимизированная селекция антител
на живых клетках

Оптимизированная селекция антител
на живых клетках
A клетки до очистки
B после очистки
C фракция клеток связанных с
микросферами (увел. х10)
D (увел. х20)

Оптимизированная селекция антител
на живых клетках

Оптимизированная селекция антител
на живых клетках

ОСНОВНЫЕ ТИПЫ ДИСПЛЕЯ НА НИТЧАТОМ ФАГЕ

ДИСПЛЕЙ ОСНОВАННЫЙ НА ФАГЕ ЛАМБДА
белок gpD
белок gpV
1. gpD – 420 копий
2. N- и C-концы белка gpD используются для дисплея
3. gpD не чувствителен к размеру встройки полипептида
4. 50-90% общего белка gpD приходятся на
рекомбинантный gpD в системе, основанной на двух генах
1. gpV – около 200 копий
2. C-конец белка gpV используются
для дисплея

DIFFERENCE BETWEEN LAMBDA AND FILAMENTOUS PHAGES
M13 собирается на
бактериальной мембране
Ламбда является литическим
фагом
bacterial cell
bacterial cell

СЕЛЕКЦИЯ ОПУХОЛЕВЫХ АНТИГЕНОВ
КОМБИНАЦИЯ МЕТОДA SEREX И ФАГОВОГО ДИСПЛЕЯ

Скрининг библиотеки
перенос бляшек
на мембрану
инкубирование
фильтра с сывороткой
БИБЛИОТЕКА
окрашивание
хроматогенным
субстратом

Идентификация опухолевых антигенов путем
скрининга библиотек кДНК, экспонированных на
поверхности фага лямбда, с помощью
сывороток пациентов
A
B

СЕЛЕКЦИЯ ОПУХОЛЕВЫХ АНТИГЕНОВ
Список библиотек кДНК, экспонированных на бактериофаге лямбда.

A
B
….
ELISA с отдельными сыворотками
1й раунд селекции
фаговые пулы
Библиотека cDNA на фаге λ
B9
B11
B13
B20
p20I
p13I
p11I
p9I
….
B9
B11
B13
B20
2ой раунд селекции
фаговые пулы
p20II
p13II
p11II
p9II
иммуноскрининг
СЕЛЕКЦИЯ ОПУХОЛЕВЫХ АНТИГЕНОВ

СЕЛЕКЦИЯ ОПУХОЛЕВЫХ АНТИГЕНОВ/иммуноскрининг

СЕЛЕКЦИЯ ОПУХОЛЕВЫХ АНТИГЕНОВ
Название каждого клона включает название библиотеки (Т1, Т2 и т. д.) и порядковый номер клона.

АНАЛИЗ ЭКСПРЕССИИ ОПУХОЛЕВЫХ АНТИГЕНОВ

ИССЛЕДОВАНИЕ ГУМОРАЛЬНОГО ИММУННОГО ОТВЕТА У ПАЦИЕНТОВ
С ОПУХОЛЯМИ МОЛОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ

ИССЛЕДОВАНИЕ ГУМОРАЛЬНОГО ИММУННОГО ОТВЕТА У ПАЦИЕНТОВ С ОПУХОЛЯМИ МОЛОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ

Значимость встречаемости антител в зависимости от стадии болезни (Р).
ИССЛЕДОВАНИЕ ГУМОРАЛЬНОГО ИММУННОГО ОТВЕТА У ПАЦИЕНТОВ С ОПУХОЛЯМИ МОЛОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ

Дисплей scFv антител на фаге ламбда
filamentous phage
lambda phage

Дисплей scFv антител на фаге ламбда

Дисплей scFv антител на фаге ламбда

Дисплей scFv антител на фаге ламбда

Дисплей scFv антител на фаге ламбда

Lambda-GFP
GFP
AP+scFv
scFv
Lambda-AP-scFv
GFP+scFv
Двойной дисплей на фаге ламбда

Двойной дисплей на фаге ламбда

Двойной дисплей на фаге ламбда

in vitro
Иммуннологическое окрашивание нефиксированных клеток LoVo
and HT29 фагом GFP/α-CEA-λ.
Двойной дисплей на фаге ламбда

in vivo
Кинетика распределения фага ламбда в мышах nude
после введения в вену, внутрибрюшинно и орально

in vivo
Таргетинг опухоли фагами введенными внутривенно
LoVo
HT29

Спасибо за внимание