Ферменты гидролиза и биосинтеза нуклеиновых кислот

Международная классификация ферментов
КФ 1 (EC 1): Оксидоредуктазы, катализирующие окисление или восстановление. Примеры: каталаза, катализирующие окисление или восстановление. Примеры: каталаза, алкогольдегидрогеназа
КФ 2 (EC 2): Трансферазы, катализирующие перенос химических групп с одной молекулы субстрата, катализирующие перенос химических групп с одной молекулы субстрата на другую. Среди трансфераз особо выделяют киназы, катализирующие перенос химических групп с одной молекулы субстрата на другую. Среди трансфераз особо выделяют киназы, переносящие фосфатную группу, как правило, с молекулы АТФ.
КФ 3 (EC 3): Гидролазы, катализирующие гидролиз, катализирующие гидролиз химических связей. Примеры: эстеразы, катализирующие гидролиз химических связей. Примеры: эстеразы, пепсин, катализирующие гидролиз химических связей. Примеры: эстеразы, пепсин, трипсин, катализирующие гидролиз химических связей. Примеры: эстеразы, пепсин, трипсин, амилаза, катализирующие гидролиз химических связей. Примеры: эстеразы, пепсин, трипсин, амилаза, липопротеинлипаза
КФ 4 (EC 4): Лиазы, катализирующие разрыв химических связей без гидролиза с образованием двойной связи в одном из продуктов.
КФ 5 (EC 5): Изомеразы, катализирующие структурные или геометрические изменения в молекуле субстрата.
КФ 6 (EC 6): Лигазы, катализирующие образование химических связей между субстратами за счет гидролиза АТФ, катализирующие образование химических связей между субстратами за счет гидролиза АТФ. Примеры: ДНК-полимераза

Нуклеаза (EC-3) - фермент, расщепляющий нуклеиновые кислоты в живых организмах.
Нуклеазы участвуют: - в переваривании нуклеиновых кислот пищи;
- в удалении чужеродных нуклениновых кислот; и
- в регуляции синтеза и распада нуклеиновых кислот в клетках.

Энзиматический гидролиз
Экзо- и эндонкулеазы
с 3’- или 5’-конца либо по середине цепи
Расщепление цепи по а- и b- типу.
продукт 5’-фосфат – а-тип (N-p-N)
продукт 3’-фосфат – b-тип (N-p-N)
Специфичность к ДНК или РНК
ДНазы и РНазы
Отношение к фосфату
фосфодиэстеразы
Фосфомоноэстеразы

Экзонуклеаза
5’-NMP
с 5’- конца
a
дц ДНК
5’-экзонуклеаза из E.coli инф бф λ
5’-NMP
с 3’- конца + свобод ОН-группа
оц ДНК в 40000 быстрее
Экзонуклеаза I из E.coli
5’-NMP
с 3’- конца
а
дц ДНК
Экзонуклеаза III из E.coli
3’-NMP
с 5’- конца
b
ДНК/РНК
Фосфодиэстераза селезенки
корот. ОН как с 5’- и с 3’- конца
с 3’- конца
Cпецифичность
олигонуклеотиды
оц ДНК
Экзонуклеаза VII из E.coli
5’-NМP
а
ДНК/РНК
Фосфодиэстераза змеиного яда
Продукт реакции
Тип
Субстрат
Фермент

Эндонуклеазы

Эндонуклеазы рестрикции
(рестриктазы)

В 1973 году Смит и Натанс предложили номенклатуру рестриктаз, включающую следующие пункты: 1. Аббревиатура названия каждого фермента является производной от бинарного названия микроорганизма, содержащего данную метилазно-рестриктазную систему. Составляют по правилу: к первой прописной букве названия рода добавляют две первые строчные буквы вида. Streptomyces albus - Sal, Escherichia coli - Eco
2. В случае необходимости добавляют обозначение серотипа или штамма, например, Есо B.
3. Различные системы рестрикции - модификации, кодируемые одной бактериальной клеткой, обозначают римскими цифрами: Hind II, Hind I, Hind III (Haemophilus influenzae).
4. Рестриктазы обозначают буквой R (R Hind III), метилазы - М (М Hind III).
Открытие новых рестриктаз заставило Робертса в 1978 году внести дополнения в систему рациональных обозначений ферментов: если сокращенное название совпадает для нескольких ферментов, то 2 первые буквы аббревиатуры остаются неизменными, а третья берется из последующих букв видового названия:
Haemophilus parainfluenzae - Hpa I
Haemophilus parahaemolyticus - Hph I.
Изошизомеры – ферменты рестрикции выделенные из разных источников и узнающие одинаковые последовательности.

Рестрикция ДНК и гель-электрофорез рестриктных фрагментов

Ферменты синтеза нуклеиновых кислот
ДНК-полимераза
РНК-зависимая ДНК полимераза
РНК-полимераза
Poly(A)-полимераза
ДНК-лигаза
РНК-лигаза
Терминальная трансфераза
Полинуклеотидкиназа
Щелочная фосфатаза

ДНК-полимераза I (E.coli)
Фермент состоит из одной полинуклеотидной цепи (мол. Масса 109 000) обладающей тремя типами ферментартивной активности.
деградирует дцДНК с 5’-конца
дцДНК→рN+оцДНК
5’-3’-экзонуклеазная
деградирует дц- или оцДНК начиная со свободного 3’-ОН конца,
Активность на дцДНК блокируется 5’-3’-полимеразной акт.
дцДНК/оцДНК→pN+дцДНК
3’-5’-экзонуклеазная
(корректирующая)
оцДНК (матрица) +затравка (праймер)
ДНКон+ndNTP→ДНК(pdN)n+nPPi
5’-3’-полимеразная
Субстратная специфичность
Реакция
Активность
Применение:
Внесение метки в ДНК с помощью ник-трансляции
При синтезе второй цепи кДНК.

Большой фрагмент ДНК-полимераза I E.coli
(фрагмент Кленова)
Фермент состоит из одной полипептидной цепи (мол.масса 76000), полученной при расщеплении нативной ДНК полимеразы I субтилизином. Обладает 5’-3’ полимеразной активностью и
3’-5’ экзонуклеазной активностью.
Применение:
Достраивание укороченных 3’-концов, образовавшихся при расщеплении
ДНК ферментами рестрикции.
2) Концевое включение метки в фрагмент ДНК
3) Синтез второй цепи кДНК при клонировании
4) Определение нуклеотидной последовательности по Сенгеру
5) Расщепление выступающих 3’-концов

ДНК полимераза фага Т4
(из E.coli, инфицированной фагом Т4)
Подобно фрагменту Кленова ДНК-полимеразы I из E.coli.
Обладает 5’-3’ полимеразной активностью и 3’-5’-экзонуклеазной активностью. Однако экзонуклеазная активность ДНК-полимеразы фага Т4 более чем в 200 раз превышает экзонуклеазную активность ДНК-полимеразы I.
Реакция обмена.
В присутствии только одного dNTP в результате 3’-5’-нуклеазной активности фермента происходит деградация дцДНК, начиная с 3’-ОН-конца до основания, комплементарного внесенному dNTP. Далее с этого места начинается серия реакций синтеза и обмена.
Применение
Концевое включение метки в фрагмент ДНК с выступающими 5’-концами
Концевое включение метки в фрагмент ДНК с тупыми концами или выступающими 5’-концами
Включение метки в фрагменты ДНК, используемые в качестве гибридизационных зондов.
Определение нуклеотидной последовательности ДНК «плюс-минус» методом

Полинуклеотидкиназа фага Т4
Фермент катализирует перенос γ-фосфата на 5’-ОН-конец ДНК или РНК
Применение
Включение метки в 5’-концы ДНК для определения последовательности по методу Максама-Гилберта
Фосфорилирование синтетических линкеров и различных фрагментов ДНК, у которых отсутствует концевой 5’-фосфат перед лигирование.

РНК-зависимая ДНК полимераза
(обратная транскриптаза)
Фермент состоит из двух полипептидов цепей, один из которых обладает и 5’-3’-полимеразной активностью, и специфической по отношению к РНК-ДНК-гибридам двухсторонней рибонуклеазной активностью.
Применение:
Синтез кДНКдля клонирования (и первой и второй цепи) или для использования в качестве гибридизационных зондов.
Концевое включение метки в ДНК с выступающими 5’-концами (реакция достраивания)

Щелочная фосфатаза
(из бактерий (BAP), из кишечника теленка (CIP))
Фермент катализирует отщепление 5’-фосфатных остатков ДНК, РНК, рибо- и дезоксирибонуклеозидтрифосфатов.
Применение
Отщепление 5’-фосфатов от ДНК или РНК перед включением 5’-концевого 32Р
Отщепление 5’-фосфатов от фрагментов ДНК для предотвращения сшивания концов одной молекулы.

Poly(A)-полимераза (E.coli)
Фермент катализирует присоедиение АМР (полученных из АТР) к свободному 3’-ОН-концу РНК
Применение
Подготовка poly(A)-РНК для клонирования
Включение метки в 3’-конец РНК с помощью [a-32Р]АТР для получения гибридизационных зондов

ДНК-лигаза фага Т4
Фермент состоит из одной полипептидной цепи (мол.масса 68000), катализирует образование фосфодиэфирной связи между 3’-OH и 5’-фосфатными концами ДНК
Применение
Сшивание молекул ДНК с совместимыми липкими концами.
Сшивание двухцепочечных молекул ДНК с тупыми концами друг с другом или синтетическими линкерами. Активность ДНК-лигазы фага Т4 по отношению к молекулам ДНК с тупами концами может быть повышена примерно в 20 раз при добавлении РНК-лигазы фага Т4

РНК-лигаза фага Т4
Фермент катализирует ковалентное соединение фосфорилированных по 5’-концу одноцепочечных ДНК или РНК с одноцепочечными ДНК или РНК имеющими 3’-гидроксильные группы
Применение
РНК-лигаза фага Т4 повышает эффективность сшивания двухцепочечных молекул ДНК с тупыми концами, катализируемого ДНК-лигазой фага Т4

Терминальная дезоксинуклеотидилтрансфераза
(из тимуса теленка)
Фермент катализирует присоедиение дезоксинуклеотидов к 3’-ОН-концу молекулы ДНК.
Применеиние
Присоединение комплементарных концевых гомополимерных последовательностей к вектору или к кДНК
Включение метки в 3’-концы фрагментов ДНК с помощью меченого 32P-3’нуклеозида. Для введения метки в составе рибонуклеозида используют [α-32Р]rNTP с последующей обработкой щелочью.