Исследование антиоксидантных и прооксидантных свойств некоторых структурно близких флавоноидов

Содержание
Актуальность исследования
Цель и задачи
Материалы и методы
Результаты
Выводы
V
V
V
V
V

Актуальность темы
Свободные радикалы неминуемо образуются в клетке в процессе жизнедеятельности и, присутствуя в живых системах, вызывают повреждения макромолекул в клетке, что приводит к ряду негативных последствий.
Как у растительных организмов, так и у животных имеются специальные антиоксидантные системы, функция которых и сводится к инактивации свободных радикалов. Условно такие системы можно разделить на две части: первая включает такие ферменты, как пероксидазу, каталазу, супероксиддисмутазу, а вторая - аскорбиновую кислоту, гидрохинон, кверцетин и другие низкомолекулярные соединения
В ходе исследований показано, что наиболее токсичные радикальные продукты пероксидазного окисления удаляются, главным образом, отдельными биоантиоксидантами, к которым относятся и флавоноиды. Установлено также, что флавоноиды обладают выраженными антиаллергическими, антиканцерогенными, противовоспалительными и противовирусными свойствами

Цели и задачи
Цель настоящей работы:
изучение антиоксидантных и прооксидантных свойств структурно близких флавоноидов в процессах, сопровождающихся генерацией АФК, первичных и вторичных свободных радикалов.
В соответствии с целью данной работы были поставлены следующие задачи:
изучить влияние таких флавоноидов, как кверцетина, эпикатехина и гесперетина, на ПОЛ, вызванное различными индукторами;
исследовать влияние выше указанных флавоноидов на процесс метаболической активации аминобифенилов по пероксидазному пути окисления;
изучить возможность данных флавоноидов выступать в качестве субстратов для пероксидазы;

Материалы и методы
В работе использовались следующие вещества и ферменты:
3,3’,5,5’-тераметилбензидин, кверцетин, гесперетин, эпикатехин, лецитин соевый производства «Sigma», США
НАДН производства «Renaul» Венгрия
Твин 20 производства «Ferak», Германия
ДНК фага λ производства «Сибэнзим», Россия
o-дианизидин, пероксид водорода, диметилформамид, С2Н5ОН, хлороформ, FeSO4, тиобарбитуровая кислота и другие реактивы квалификации марки «ЧДА»
пероксидаза из хрена (КФ 1.11.1.7) с Rz = 3 и СОД (КФ 1.15.1.1) производства «Fluka», США
Во время выполнения работы были использованы следующие методы анализа:
спектральные (измерения проводили на спектрофотометрах Solar PV 150, UV-VIS Cary-50 в УФ и видимом диапазоне длин волн )
электрофоретические.

Основная часть
Общая структура флавоноидов
Флавоноиды – это фенольные соединения, широко распространённые в природе.
Общая структура флавоноидов (С6 — С3 — С6 ) представлена двумя ароматическимих кольцами, соединенными тремя углеродными атомами, наиболее часто с образованием гетероциклического кольца

Механизмы антиоксидантной активности флавоноидов могут быть следующие :
Подавление формирования активных форм кислорода путем ингибирования ферментов или хелатирование микроэлементов, учавствующих в образовании свободных радикалов.
Удаление активных форм кислорода. Благодаря более низким окислительно-восстановительным потенциалам, флавоноиды (Fl-ОН) способны восстанавливать высоко окисленные свободные радикалы
Сверхрегулирование или защита протекторов антиоксидантов

Накопление продуктов ПОЛ в присутствии кверцетина, гесперетина и эпикатехина
На рисунке слева представлено накопление продуктов ПОЛ, индуцированное СФ, в присутствии кверцетина, гесперетина и эпикатехина (1.- спонтанное ПОЛ, 2.- ПОЛ, индуцированное СФ (2⋅10-4М Fe2+/2⋅10-5 М Н2О2) в отсутствии флавоноидов; для флавоноидов : 3.- 1⋅10-7М, 4. - 5⋅10-7 М,5.- 1⋅10-6 М,6.- 5⋅10-6 М,7.- 1⋅10-5 М, 8. - 5⋅10-5 М,9. - 1⋅10-4 М)
На рисунке справа представлено накопление продуктов ПОЛ, индуцированное Fe2+, в присутствии кверцетина, гесперетина и эпикатехина (1.- спонтанное ПОЛ, 2.- ПОЛ, индуцированное Fe2+ в концентрации 2⋅ 10-4 М в отсутствие флавоноидов;для флавоноидов : 3.- 1⋅10-7М, 4. - 5⋅10-7 М, 5. - 1⋅10-6 М,6.- 5⋅10-6 М,7.- 1⋅10-5 М, 8. - 5⋅10-5 М,9. - 1⋅10-4 М)
Примечание II: * - различия достоверны при р ≤ 0,05

Пероксидазное окисление
3, 3’,5,5’-тераметилбензидина (ТМБД)
Подробный механизм
окисления ТМБД

Влияние флавоноидов на процесс пероксидазного окисления
3,3’,5,5’-тераметилбензидина
Пероксидазное окисление ТМБД в 0,1 М цитратно - ацетатном буфере рН 5,5 (конечный объём реакционной смеси составлял 2,5 мл и содержал [Н2О2]=0,4 мМ/л, [ПХ]=10-11 М, [ТМБД]= 0,6 мМ/л) в присутствии кверцетина:
1 - [кверцетин] =0 мкМ/л, 2 - [кверцетин] =0,01 мкМ/л, 3 - [кверцетин] =0,04мкМ/л, 4 - [кверцетин] =0,08 мкМ/л, 5 - [кверцетин] =0,12 мкМ/л, 6 - [ кверцетин] =0,2 мкМ/л, 7 - [кверцетин] =0,6 мкМ/л, 8 - [кверцетин] =1 мкМ/л, 9 - [ кверцетин] =4 мкМ/л.

Химические формулы кверцетина, гесперетина и эпикатехина

Пероксидазное окисление кверцетина
Окисление протекало в 0,1 М цитратно – ацетатном буфере (рН 5,5), [ПХ]= 10-11 М, [Н2О2]=50 мкмоль/л:
1 - [кверцетин] = 75 мкмоль/л, 2 - [кверцетин] = 65 мкмоль/л, 3 - [кверцетин] =55 мкмоль/л, 4 - [кверцетин] =45 мкмоль/л, 5 - [кверцетин] =35 мкмоль/л, 6 - [кверцетин] = 25 мкмоль/л, 7 - [кверцетин] = 20 мкмоль/л, 8 - [кверцетин] = 10 мкмоль/л, 9 - [кверцетин] = 5 мкмоль/л.

Пероксидазное окисление эпикатехина
Окисление протекало в 0,1 М цитратно – ацетатном буфере (рН 5,5), [Н2О2]=50 мкмоль/л :
На рисунке слева: [ПХ]= 10-11 М, 1 - [эпикатехин] = 105 мкмоль/л, 2 - [эпикатехин] = 95 мкмоль/л, 3 - [эпикатехин] =85 мкмоль/л, 4 - [эпикатехин] =75 мкмоль/л, 5 - [эпикатехин] =55 мкмоль/л, 6 - [эпикатехин] = 25 мкмоль/л, 7 - [эпикатехин] = 20 мкмоль/л, 8 - [эпикатехин] = 5 мкмоль/л.
На рисунке справа: [ПХ]= 10-9 М, 1 - [эпикатехин] = 105 мкмоль/л, 2 - [эпикатехин] = 95 мкмоль/л, 3 - [эпикатехин] =75 мкмоль/л, 4 - [эпикатехин] =65 мкмоль/л, 5 - [эпикатехин] =55 мкмоль/л, 6 - [эпикатехин] = 45 мкмоль/л, 7 - [эпикатехин] = 35 мкмоль/л, 8 - [эпикатехин] = 25 мкмоль/л, 9 - [эпикатехин] = 20 мкмоль/л, 10 - [эпикатехин] =10 мкмоль/л, 11 - [эпикатехин] =5 мкмоль/л

Электрофореграмма ДНК фага λ, инкубированной в системе пероксидазного окисления о-дианизидина
Электрофореграмма ДНК фага λ, инкубированной в системе пероксидазного окисления о-дианизидина ([ДНК] =0,4мкг, [Н2О2] = 1 ммоль/л, [ПХ] = 10-7 моль/л):
1. ДНК, 2. ДНК, ПХ, Н2О2, 3. ДНК, ПХ, о-дианизидин 5⋅10-5 моль/л, 4. ДНК, ПХ, Н2О2, о-дианизидин 10-7 моль/л, 5. ДНК, ПХ, Н2О2, о-дианизидин 2,5⋅10-7 моль/л, 6. ДНК, ПХ, Н2О2, о-дианизидин 5⋅10-7 моль/л, 7. ДНК, ПХ, Н2О2, о-дианизидин 10-6 моль/л,8. ДНК, ПХ, Н2О2, о-дианизидин 2,5⋅10-6 моль/л, 9. ДНК, ПХ, Н2О2, о-дианизидин 5⋅10-6 моль/л, 10. ДНК, ПХ, Н2О2, о-дианизидин 10-5 моль/л, 11. ДНК, ПХ, Н2О2, о-дианизидин 2,5⋅10-5 моль/л, 12. ДНК, ПХ, Н2О2, о-дианизидин 5⋅10-5 моль/л.

Влияние кверцетина на повреждение ДНК продуктами пероксидазного окисления о-дианизидина
Электрофореграмма ДНК фага λ, инкубированной в системе пероксидазного окисления о-дианизидина ( [о-дианизидин]= 5⋅10-6 моль/л, [ДНК] =0,4мкг, [Н2О2] = 1 ммоль/л, [ПХ] = 10-7 моль/л) с различными концентрациями кверцетина :
1. ДНК, 2. ДНК, ПХ, Н2О2, 3. ДНК, ПХ, о-дианизидин, 4. ДНК, ПХ, Н2О2, о-дианизидин, 5. ДНК, ПХ, Н2О2, о-дианизидин, кверцетин 1⋅10-8 моль/л, 6. ДНК, ПХ, Н2О2, о-дианизидин, кверцетин 5⋅10-8 моль/л, 7. ДНК, ПХ, Н2О2, о-дианизидин, кверцетин 1⋅10-7 моль/л, 8. ДНК, ПХ, Н2О2, о-дианизидин, кверцетин 5⋅10-7 моль/л, 9. ДНК, ПХ, Н2О2, о-дианизидин, кверцетин 1⋅10-6 моль/л, 10. ДНК, ПХ, Н2О2, о-дианизидин, кверцетин 5⋅10-6 моль/л, 11. ДНК, ПХ, Н2О2, о-дианизидин, кверцетин 1⋅10-5 моль/л, 12. ДНК, ПХ, Н2О2, о-дианизидин, кверцетин 1⋅10-4 моль/л.

Влияние эпикатехина на повреждение ДНК продуктами пероксидазного окисления о-дианизидина
Электрофореграмма ДНК фага λ, инкубированной в системе пероксидазного окисления о-дианизидина ( [о-дианизидин]= 5⋅10-6 моль/л, [ДНК] =0,4мкг, [Н2О2] = 1 ммоль/л, [ПХ] = 10-7 моль/л) с различными концентрациями эпикатехина:
1. ДНК, 2. ДНК, ПХ, Н2О2, 3. ДНК, ПХ, о-дианизидин, 4. ДНК, ПХ, Н2О2, о-дианизидин, 5. ДНК, ПХ, Н2О2, о-дианизидин, эпикатехин 1⋅10-8 моль/л, 6. ДНК, ПХ, Н2О2, о-дианизидин, эпикатехин 5⋅10-8 моль/л, 7. ДНК, ПХ, Н2О2, о-дианизидин, эпикатехин 1⋅10-7 моль/л, 8. ДНК, ПХ, Н2О2, о-дианизидин, эпикатехин 5⋅10-7 моль/л, 9. ДНК, ПХ, Н2О2, о-дианизидин, эпикатехин 1⋅10-6 моль/л, 10. ДНК, ПХ, Н2О2, о-дианизидин, эпикатехин 5⋅10-6 моль/л, 11. ДНК, ПХ, Н2О2, о-дианизидин, эпикатехин 1⋅10-5 моль/л, 12. ДНК, ПХ, Н2О2, о-дианизидин, эпикатехин 1⋅10-4 моль/л.

Влияние гесперетина на повреждение ДНК продуктами пероксидазного окисления о-дианизидина
Электрофореграмма ДНК фага λ, инкубированной в системе пероксидазного окисления о-дианизидина ([о-дианизидин]= 5⋅10-6 моль/л, [ДНК] =0,4мкг, [Н2О2] = 1 ммоль/л, [ПХ] = 10-7 моль/л) с различными концентрациями гесперетина :
1. ДНК, 2. ДНК, ПХ, Н2О2, 3. ДНК, ПХ, о-дианизидин, 4. ДНК, ПХ, Н2О2, о-дианизидин, 5. ДНК, ПХ, Н2О2, о-дианизидин, гесперетин 1⋅10-8 моль/л, 6. ДНК, ПХ, Н2О2, о-дианизидин, гесперетин 5⋅10-8 моль/л, 7. ДНК, ПХ, Н2О2, о-дианизидин, гесперетин 1⋅10-7 моль/л, 8. ДНК, ПХ, Н2О2, о-дианизидин, гесперетин 5⋅10-7 моль/л, 9. ДНК, ПХ, Н2О2, о-дианизидин, гесперетин 1⋅10-6 моль/л, 10. ДНК, ПХ, Н2О2, о-дианизидин, гесперетин 5⋅10-6 моль/л, 11. ДНК, ПХ, Н2О2, о-дианизидин, гесперетин 1⋅10-5 моль/л, 12. ДНК, ПХ, Н2О2, о-дианизидин, гесперетин 1⋅10-4 моль/л.

Выводы
Было показано, что в процессе перекисного окисления лецитина, индуцированного системой Фентона ([Fe2+]= 2⋅10-4 моль/л, ([Н2О2]= 2⋅10-5 моль/л), кверцетин, эпикатехин и гесперетин проявляют прооксидантные свойства. Наибольшая прооксидантная активность проявляется кверцетином в концентрации 5⋅10-7 моль/л, гесперетином - 1⋅10-7 моль/л, эпикатехином - 1⋅10-6 моль/л.
Установлено, что если в качестве индуктора перекисного окисления липидов выступает Fe2+ (2⋅10-4 моль/л), то кверцетин проявляет антиоксидантные свойства и максимальная антиоксидантная активность наблюдается в концентрации 1⋅10-4 моль/л. Эпикатехин и гесперетин в указанных условиях проявляют как антиоксидантные, так и прооксидантные свойства. Гесперетин проявляет антиоксидантную активность в концентрациях 5⋅10-7 - 1⋅10-6 моль/л, а прооксидантную - 5⋅10-6 и 5⋅10-5 моль/л. Эпикатехин выступает антиоксидантом в концентрациях с 1⋅10-6 по 1⋅10-5 моль/л, а при концентрации 1⋅10-4 моль/л наблюдается прооксидантный эффект.

Показано, что кверцетин и эпикатехин в концентрациях 1 мкмоль/л и 4 мкмоль/л проявляют антиоксидантные свойства в отношении процесса пероксидазного окисления 3,3’,5,5’-тераметилбензидина, при этом кверцетин гораздо эффективнее подавляет окисление данного аминобифенила. Наиболее вероятно, что при совместном окислении тетраметилбензидина и флавоноидов (кверцетина, эпикатехина) происходит активация окисления медленно окисляемого субстрата (флавоноида) и частичное или полное ингибирование превращения быстро окисляемого субстрата (аминобифенила)
Было установлено, что кверцетин и эпикатехин, проявляя антиоксидантные свойства, способны подвергаться окислению в системе пероксидаза/ Н2О2. В случае кверцетина наиболее вероятным механизмом является одноэлектронное окисление флавоноида:
пх/ Н2О2
Fl → Fl⋅
( одноэлектронное окисление)
Fl⋅ +НАДН → Fl + НАД⋅
НАД⋅ + О2 → НАД+ + ⋅О2 –

Установлено, что все три флавоноида – кверцетин, эпикатехин и гесперетин - проявляют антиоксидантные свойства и ингибируют повреждение ДНК радикалами, образующимися в ходе пероксидазного окисления о-дианизидина. Наиболее эффективными ингибиторами являются кверцетин, эпикатехин (в концентрации 5⋅10-7 моль/л), менее эффективен гесперетин (1⋅10-5 моль/л).