Клеточные технологии в лечении социально-значимых заболеваний

Крупнейшие открытия биологии в XX веке
Открытие двойной спирали ДНК (1953)
Расшифровка генома человека (2001)
Выделение эмбриональных стволовых клеток человека (1998)

Марио Капечи
Мартин Эванс
Оливер Смитис
Открытие принципов введения специфических генных модификаций у мышей с использованием эмбриональных стволовых клеток
Лауреаты Нобелевской премии по физиологии и медицине за 2007 год

Медицинская и социальная значимость проблемы
Вложения в биотехнологические компании превышают 30 миллиардов долларов в год
Клеточные технологии необходимы более чем 128 млн. пациентов
Данные по США

Клеточные технологии – приоритетное направление развития медицинской науки
(Решение 76-й сессии РАМН от 17.02.2004)
Клеточные технологии внесены в Перечень критических технологий РФ
(Пр-842 Президента РФ от 21.05.2006)
Правительственная комиссия по высоким технологиям и инновациям
(Протокол №2 от 23.09.2008)

Зарегистрированные FDA клинические испытания

Клеточно-генные технологии для
лечения диабета
Распространение диабета в мире постепенно достигает эпидемических масштабов
Сегодня более 5 миллионов человек по всему миру больны диабетом первого типа, 395 тысяч из них – дети.
Ежегодно число больных увеличивается на 5-7%, а каждые 12-15 лет - удваивается
Высокая смертность и ранняя инвалидизация

Методы лечения диабета I типа
Инсулинотерапия
Трансплантация поджелудочной железы (островков Лангерганса)
Клеточные технологии и клеточно-генные технологии

Pdx-1 (IDX-1/ STF-1/ IPF-1) – ключевой фактор в развитии поджелудочной железы (ПЖ)
Экспрессия Pdx-1 начинается в эпителии первичной кишечной трубки (около 30 дней эмбрионального развития) в ограниченной области
Эмбрионы мыши, имеющие мутацию по гену Pdx-1, погибают в первые дни после рождения (отсутствует морфогенез ПЖ)
Во взрослой ПЖ Pdx-1 экспрессируется только в
β-клетках и очагах неогенеза эндокринной ткани
Pdx-1 необходим для экспрессии нескольких генов β-клеток : инсулина, амилина, глюкокиназы, GLUT-2

Основные этапы технологии
Забор жировой ткани пациента
Изоляция МСК ЖТ
Селекция периваскулярной фракции МСК ЖТ
Культивирование в селективной среде
Трансфекция культуры клеток rAd5-PDX-1
Созревание «островков», продуцирующих инсулин

Получение рекомбинантного аденовируса 5 серотипа, несущего ген Pdx-1 (pAd5-Pdx1)
Плазмида pAd5- Pdx1
способность инфицировать неделящиеся клетки
большая емкость (до 28 т.п.н.), позволяющая клонировать практически любой ген человека
высокий титр вирионов (до 10^11) при выделении из упаковочной линии
автономную локализацию, исключающую опасность инсерций в геном
разрешены к применению в генной терапии
Преимущества аденовирусных векторов:

Сравнительная эффективность трансдифференцировки МСК ЖТ в
общей и в изолированной популяции
Общая популяция
Изолированная популяция

Влияние различных индукторов дифференцировки на уровень мРНК гена Insulin в трансфицированных клетках периваскулярного фенотипа
*
*
*
1 -контроль
2 - трансфицированные клетки в базовой среде
3 - в среде CMRL-1066
4 - в среде CMRL-1066 с GLP-1, 5- в среде CMRL-1066 с ретиноевой кислотой
6 - в среде CMRL-1066 с никотинамидом
7 - в среде CMRL-1066 с ретиноевой кислотой, GLP-1 и никотинамидом
8 - в среде CMRL-1066 с GLP-1 и ретиноевой кислотой.
* - p<0,05
Относительный уровень мРНК
*
*
*
*
*
*
*

Секреция инсулина трансфицированными МСК периваскулярного фенотипа из ЖТ и ПК
Pdx-1
инсулин
Pdx-1/ инсулин

Секреция инсулина трансфицированными МСК периваскулярного фенотипа из ЖТ и ПК
Количество инсулина в среде (мЕ/л) при добавлении глюкозы
1 - среда с не трансфицированных клеток
2 - среда с трансфицированных клеток с содержанием глюкозы 5,56 mmol/л
3 - среда с трансфицированных клеток с содержанием глюкозы 25 mmol/л
* - р<0,05
*
*

Инсулин-продуцирующие островки in vitro
Впервые разработан метод получения функционально активных инсулин-продуцирующих клеток из популяций МСК жировой ткани и пупочного канатика человека периваскулярного фенотипа (CD146+CD31-) путем транзиентной трансфекции геном Pdx1 с добавлением этапа культивирования в дифференцировочной среде