Лабораторная диагностика нарушений гемостаза

Проблема не в том, чего вы не знаете...А в том, в чѐм вы уверены на 100%. На самом деле всѐ абсолютно не так!
Марк
Марк Твен

Система гемостаза – что это?
Биологическая система, обеспечивающая, с одной стороны, сохранение жидкого состояния циркулирующей крови, а с другой, - предупреждение и купирование кровотечений, обозначается как система гемостаза
Баркаган З.С., 2001

Гемостаз для чайников?

Механизмы работы системы гемостаза сложны, но суть нормальной её работы проста - это поддержание гемостатического баланса между факторами свертывания и антикоагулянтными факторами. При смещении гемостатического баланса за рамки физиологических норм возникают условия для развития патологических кровотечений или тромбозов
Долгов В.В., 2005.

*
Гемостаз в норме

Функционирование системы гемостаза определяется состоянием трех тесно взаимодействующих между собой компонентов:
- стенками кровеносных сосудов (в первую очередь эндотелием и субэндотелиальными структурами);
- клеточными элементами крови (в первую очередь тромбоцитами);
- плазменными протеолитическими системами: свертывающей, противосвертывающей (в том числе фибринолитической).

Гемостаз
Первичный или
сосудисто-тромбоцитарный
Вторичный (коагуляционны) или
плазменный
хотя оба этих механизма взаимно индуцируют друг друга.

Пока эндотелий цел, не поврежден, он обладает высоким антитромботическим потенциалом, что определяется следующими его свойствами :
отрицательной заряженностью
в мембране ЭК – тромбомодулин, связывающий и инактивирующий тромбин, ( этот комплекс) активирует мощную антикоагулянтную систему протеина С
продуцирует простагландин I2 мощный вазодилататор и ингибитора агрегации тромбоцитов
продуцирует ингибитор внешнего пути свертывания крови (TEFI);
продуцирует тканевый активатор, который стимулирует фибринолиз
На гипокоагуляцию (антитромботический потенциал) !!!

При повреждении эндотелия его антитромботические свойства трансформируются в мощный протромботический потенциал, определяющийся следующими механизмами:
секрецией мощного активатора адгезии тромбоцитов к субэндотелию (коллагену) – фактора Виллебранда (FW)
продукцией стимулятора агрегации тромбоцитов циклического простагландина – тромбоксана А2
продукцией и высвобождением тканевого тромбопластина или тканевого фактора (TF) –главного активатора основного механизма свертывания крови;
- продукцией ингибиторов активатора плазминогена (PAI).

Первичный гемостаз - формирование тромбоцитарной пробки

Необходимые компоненты первичного гемостаза
–коллаген
–тромбоциты
–фактор Von Willebrand

2 этапа сосудисто-тромбоцитарного гемостаза
1 При повреждении сосуда (как извне, так и эндогенное без разрыва) в кровь попадает большое количество БАВ-эндотелиальный релаксирующий фактор, АПФ, простоциклин (ингиб. агрегации и вазоконстрикции), изменяющих сосудистый тонус. В области повреждения формируется стаз.
2. Адгезия(прилипание к поврежденному участку сосуда) и агрегация (склеивание между собой) тромбоцитов. Адгезия тромбоцита реализуется:
- через коллаген ( на тр.- (Iа), базальной мембраны ЭК при соприкосновении с кровью (медленная адгезия в мелких соссудах)
- либо через активацию тромбоцитов вещ-ми из поврежденных ЭК- через рецепторы (Ib) даже при быстром кровотоке в крупных венах и артерих.
Локально!- ЭК активируют и ограничение роста сгустка и его разрушение. Иначе –тотальное тромбирование.

Тромбоцит
Адгезия
Агрегация (обратимая и необратимая)
Образование псевдоподий и через рецепторы (IIb-IIIa) образование комплексов, сети, связывание с АДФ и фибриногеном
Наличие рецепторов к факторам VIIIa IXa Xa XIa, а Va фактор синтезируется самими тромбоцитами;
Наличие гранул: альфа-гр I(АДФ, адреналин, серотонин,кальций, фактор роста тромбоцитов, антигепар. фактор), альфа-гр II (лизосомальные инзимы, ограничивающие рост тромба)

Тромбоциты в покое и после активации

Times New Roman
Реализация сосудисто-тромбоцитарного гемостаза обеспечивается спазмом сосудов и их механической закупоркой агрегатами тромбоцитов с образованием, так называемого белого тромбоцитарного (первичного) тромба.

Лабораторная оценка тромбоцитарного гемостаза
Количественное определение тромбоцитов.
Качественная:
ТЭГ
Агрегация тромбоцитов ( «Хроно-лог». PFA-200)

Плазменный гемостаз
Система свертывания плазмы - ферментативная система, осуществляющая каскад протеолитических реакций, в результате которых происходит образование фибриновой пробки в месте повреждения сосуда

Развитие взглядов на реакцию свертывания крови.
•«Классическая каскадная» теория –внешний и внутренний путь –1969 г.
•«Современная каскадно-матричная теория» или клеточная теория –2002 г.

В классическом каскаде коагуляции выделяют 2 пути активации процесса:

Внутренний путь необходим для формирования тромба при повреждении сосуда, не связанным с внеш. воздействием. Активация этого пути происходит при контакте коллагена базальной мембраны ЭК поврежденного сосуда с кровью + ВМК И КК, адсорбирующегося на отр. заряженной поверх. клеток вместе с XII фактором.
Внешний – при попадании в кровоток тканевого фактора при травме.
Внеш. и внутр. пути приводят к появлению Xa фактора к нему присоединяется Va фактор из тромбоцитов в месте повреждения и образуется (Xa+Va) протромбиназный комплекс, который в присутствии Са (из тромбоцитов) трансформирует протромбин в тромбин.
Этот тромбин активирует VIII и V , что приводит к резкому увеличению Xa, а затем тромбина и ловинообразному увеличению свертывания.
Финальная стадия –полимеризация фибрина , сшивание нитей между собой под воздействием XIII фактора. Образуется нерастворимый фибрин-полимер и тромб!!!

Почему была неудовлетворительна классическая теория?
Дефицит FXII (активатора внутреннего пути) не проявлялся кровотечением.
Было показано,что:
-во-первых, что комплекс ТФ-фактор VIIa - теназа внешнего пути активирует не только фактор Х, но и фактор IX.
-во-вторых, было показано, что теназа внутреннего пути - комплекс факторов VIIIа и IXа в присутствии фосфолипидов активирует фактор Х со скоростью в 50-100 раз большей, чем теназа внешнего пути;
- в третьих, было показано, что фактор XI активируется не под действием фактора XIIа, как предполагалось в классической схеме реакций, а тромбином при участии гликопротеина Iba тромбоцитов
Эти данные послужили основанием для внесения существенных модификаций в схему реакций активации свертывания крови

В настоящее время более актуальна «клеточная теория гемостаза»
Hoffman M, 2001
http://atvb.ahajournals.org/cgi/reprint/26/1/41
Или интегральная схема гемостаза in vivo

Современная каскадно-матричная теория свертывания крови, сформированная в последние десятилетия, учитывает реакции взаимодействия белков плазмы и тромбоцитов, компонентов сосудистой стенки и других клеток крови.

Согласно данной теории процесс коагуляции делится на 3 перекрывающихся фазы: фазу инициации, фазу усиления и распространения согласно динамике образования тромбина.
Данные последних исследований показали, что в начальном периоде активации свертывания крови тромбин образуется с относительно низкой скоростью, затем в процессе наступает перелом, и его скорость резко возрастает (тромбиновая вспышка)

Зачем нужен «тромбиновый взрыв»?
•Образование сгустка происходит в начале фазы распространения, но:
-Быстрое образование тромбина приводит к генерации более стабильного, плотного сгустка, устойчивого к фибринолизу.
-Большие кол-ва тромбина необходимы для подавления фибринолиза (активация TAFI).
Зачем нужен «тромбиновый взрыв»?

Одновременно тромбин активирует протвосвёртывающую систему, протеинС, которые четко локализуют тромб от здоровых сосудов, мешая ему распространятся.

Клеточная теория признаѐт наличие «наружного» и «внешнего» пути, но существенно их модифицирует

Пртивосвертывающая система
противосвертывающие белки антитромбин, кофактор гепарина II, а2 –макроглобулин, ингибиторы а1-протеазы и С1-комплемента, а так же протеин С (Си), протеин S, тромбомодулин и ингибитор пути тканевого фактора (TFPI).
При этом протеин С, активированный комплексом тромбин-тромбомодулин, вместе с S ингибируют активированные кофакторы (Va и VIIIа), а все остальные подавляют действие самих активированных факторов. TFPI ограничивает активность фактора Ха и комплекса тканевого фактора с фактором VIIа.

Фибртнолитическая система
Величина тромба также зависит от фибринолитической системы крови, состоящей из плазминогена, его активаторов и ингибиторов, определяющих уровень образующегося плазмина.

Лабораторная диагностика нарушений гемостаза
Преаналитический этап

Тесты исследования гемостаза (по принципу метода) делятся на:
1. Клоттинговые, или хронометрические тесты, которые позволяют определить биологическую активность исследуемых факторов гемокоагуляции. Единицей измерения, применяемой в данных методах, является время формирования фибринового сгустка.
2. Амидолитические методы с использованием хромогенных субстратов, в ходе которых анализируется время гидролиза пептидного субстрата.
3. Методы, которые позволяют определить концентрацию исследуемого фактора с помощью применения моноклональных антител – иммунолоические методы.
Отдельно необходимо отметить генетические методы, которые позволяют выявить наличие мутаций генов, определяющих формирование отдельных факторов свертывания крови и других участников фибринолиза и гемокоагуляционного процесса

В зависимости от вопросов, которые ставит перед собой клиницист, тесты делятся на: 1. Есть ли патология ?
лабораторные методы, которые позволяют ответить на вопрос о состоянии свертывания крови у здорового человека, у пациента при подготовке к оперативным вмешательствам или в тех случаях, когда имеются клинические признаки нарушения гемокоагуляции. Для этого достаточно проведения так называемых оценочных или скрининговых тестов:
- Количество и скрининг (PFA-200) агрегации тромбоцитов ( скрининг первичного гемостаза)
- «Простая» коагулограмма ( ПВ, АЧТВ, ТВ, Ф, РФМК) при наличии кровоточивости и при мини-операцияз
- «Развернутая» коагулограмма (ПВ, АЧТВ, ТВ, Ф, АнтIII, Пл, Фибринолиз, Д-димер, РФМК) при рисках и наличии тромбозов и предстоящих обширных операциях

2. В чем причина выявленных нарушений?
для выявления причин кровоточивости:
Время кровотечения
Агрегация тромбоцитов (в т.ч. с ристомицином, АДФ, коллагеном и адреналином),
Определение антигена и активности фактора Виллебранда,
Определение активности факторов свертывания крови
Определение ингибиторов факторов свертывания крови